Bookshelf

8.4.1. The Significance of KM and Vmax Values

Stała Michaelisa, KM, i maksymalna szybkość, Vmax, mogą być łatwo wyprowadzone z szybkości katalizy mierzonej przy różnych stężeniach substratów, jeśli enzym działa zgodnie z prostym schematem podanym w równaniu 23. Najczęściej do wyznaczenia KM i Vmax wykorzystuje się programy komputerowe do dopasowywania krzywych (alternatywne sposoby wyznaczania KM i Vmax opisano w dodatku do niniejszego rozdziału). Wartości KM enzymów są bardzo zróżnicowane (Tabela 8.5). Dla większości enzymów wartość KM mieści się w zakresie od 10-1 do 10-7 M. Wartość KM dla danego enzymu zależy od konkretnego substratu i warunków środowiskowych, takich jak pH, temperatura i siła jonowa. Stała Michaelisa, KM, ma dwa znaczenia. Po pierwsze, KM jest stężeniem substratu, przy którym połowa miejsc aktywnych jest wypełniona. Tak więc KM stanowi miarę stężenia substratu wymaganego do wystąpienia znaczącej katalizy. W rzeczywistości, w przypadku wielu enzymów, dowody eksperymentalne sugerują, że KM stanowi przybliżenie stężenia substratu in vivo. Gdy KM jest znana, frakcja miejsc wypełnionych, fES, przy dowolnym stężeniu substratu może być obliczona z

Tabela 8.5

wartości KM niektórych enzymów.

Po drugie, KM jest związany ze stałymi szybkości poszczególnych etapów schematu katalitycznego podanymi w równaniu 9. W równaniu 15, KM jest zdefiniowana jako (k-1 + k2)/k1. Rozważmy przypadek graniczny, w którym k-1 jest znacznie większe od k2. W takich okolicznościach, kompleks ES dysocjuje na E i S znacznie szybciej niż powstaje produkt. W tych warunkach (k-1 >> k2),

stała dysocjacji kompleksu ES jest dana przez

Innymi słowy, KM jest równa stałej dysocjacji kompleksu ES, jeśli k2 jest znacznie mniejsze od k-1. Gdy ten warunek jest spełniony, KM jest miarą siły kompleksu ES: wysoki KM wskazuje na słabe wiązanie; niski KM wskazuje na silne wiązanie. Należy podkreślić, że KM wskazuje na powinowactwo kompleksu ES tylko wtedy, gdy k-1 jest znacznie większe od k2.

Szybkość maksymalna, Vmax, ujawnia liczbę obrotową enzymu, która jest liczbą cząsteczek substratu przekształcanych w produkt przez cząsteczkę enzymu w jednostce czasu, gdy enzym jest całkowicie nasycony substratem. Jest ona równa stałej kinetycznej k2, która nazywana jest również kcat. Maksymalna szybkość, Vmax, ujawnia liczbę obrotów enzymu, jeśli znane jest stężenie miejsc aktywnych T, ponieważ

i tak

Na przykład, 10-6 M roztwór anhydrazy węglowej katalizuje tworzenie 0,6 M H2CO3 na sekundę, gdy jest w pełni nasycony substratem. Stąd, k2 wynosi 6 × 105 s-1. Ta liczba obrotowa jest jedną z największych znanych. Każda katalizowana reakcja zachodzi w czasie równym 1/k2, co w przypadku anhydrazy węglowej wynosi 1,7 μs. Liczby obrotowe większości enzymów z ich fizjologicznymi substratami mieszczą się w zakresie od 1 do 104 na sekundę (tabela 8.6).

Tabela 8.6

Maksymalne liczby obrotowe niektórych enzymów.

8.4.2. Doskonałość Kinetyczna w Katalizie Enzymatycznej: The kcat/KM Criterion

Gdy stężenie substratu jest znacznie większe niż KM, szybkość katalizy jest równa kcat, liczbie obrotu, jak opisano w sekcji 8.4.1. Jednakże, większość enzymów nie jest normalnie nasycona substratem. W warunkach fizjologicznych, stosunek /KM wynosi zwykle od 0,01 do 1,0. Gdy << KM, szybkość enzymatyczna jest znacznie mniejsza niż kcat, ponieważ większość miejsc aktywnych jest nieobsadzona. Czy istnieje liczba, która charakteryzuje kinetykę enzymu w tych bardziej typowych warunkach komórkowych? Rzeczywiście istnieje, co można wykazać łącząc równania 10 i 16, aby otrzymać

Gdy << KM, stężenie wolnego enzymu, , jest prawie równe całkowitemu stężeniu enzymu , więc

Tak więc, gdy << KM, prędkość enzymatyczna zależy od wartości kcat/KM, , i T. W tych warunkach, kcat/KM jest stałą szybkości dla interakcji S i E i może być użyta jako miara wydajności katalitycznej. Na przykład, używając wartości kcat/KM, można porównać preferencje enzymu dla różnych substratów. Tabela 8.7 przedstawia wartości kcat/KM dla kilku różnych substratów chymotrypsyny (Rozdział 9.1.1). Chymotrypsyna wyraźnie preferuje rozszczepianie obok nieporęcznych, hydrofobowych łańcuchów bocznych.

Tabela 8.7

Substratowe preferencje chymotrypsyny.

Jak wydajny może być enzym? Możemy podejść do tego pytania określając, czy istnieją jakieś fizyczne ograniczenia na wartość kcat/KM. Zauważmy, że stosunek ten zależy od k1, k-1 i kcat, co można wykazać zastępując KM.

Załóżmy, że szybkość tworzenia produktu (kcat) jest znacznie szybsza niż szybkość dysocjacji kompleksu ES (k-1). Wartość kcat/KM zbliża się wtedy do k1. Tak więc ostateczną granicę wartości kcat/KM wyznacza k1, szybkość tworzenia kompleksu ES. Szybkość ta nie może być większa niż kontrolowane dyfuzyjnie spotkanie enzymu z substratem. Dyfuzja ogranicza wartość k1 tak, że nie może ona być większa niż 108-109 s-1 M-1. Stąd, górna granica kcat/KM wynosi pomiędzy 108 a 109 s-1 M-1.

Stosunki kcat/KM enzymów dysmutazy ponadtlenkowej, acetylocholinoesterazy i izomerazy triozy fosforanowej wynoszą pomiędzy 108 a 109 s-1 M-1. Enzymy takie jak te, których współczynniki kcat/KM znajdują się w górnych granicach, osiągnęły doskonałość kinetyczną. Ich prędkość katalityczna jest ograniczona jedynie przez szybkość, z jaką napotykają substrat w roztworze (Tabela 8.8). Dalszy wzrost szybkości katalitycznej może nastąpić tylko poprzez skrócenie czasu dyfuzji. Należy pamiętać, że miejsce aktywne jest tylko niewielką częścią całej struktury enzymu. Jednak w przypadku enzymów katalitycznie doskonałych, każde spotkanie enzymu z substratem jest produktywne. W takich przypadkach, na enzymie mogą występować atrakcyjne siły elektrostatyczne, które przyciągają substrat do miejsca aktywnego. Siły te są czasami określane poetycko jako efekty Circe.

Tabela 8.8

Enzymy, dla których kcat/KM jest zbliżone do kontrolowanej dyfuzyjnie szybkości spotkania.

Ograniczenie narzucone przez szybkość dyfuzji w roztworze może być również częściowo pokonane przez zamknięcie substratów i produktów w ograniczonej objętości kompleksu multienzymatycznego. Rzeczywiście, niektóre serie enzymów są powiązane w zorganizowane zespoły (Sekcja 17.1.9) tak, że produkt jednego enzymu jest bardzo szybko znaleziony przez następny enzym. W efekcie, produkty są przekazywane z jednego enzymu do drugiego, podobnie jak na linii montażowej.

8.4.3. Większość reakcji biochemicznych obejmuje wiele substratów

Większość reakcji w systemach biologicznych obejmuje zwykle dwa substraty i dwa produkty i może być reprezentowana przez reakcję bisubstratową:

Większość takich reakcji wiąże się z przeniesieniem grupy funkcyjnej, takiej jak grupa fosforowa lub amonowa, z jednego substratu na drugi. W reakcjach utleniania-redukcji, elektrony są przenoszone pomiędzy substratami. Reakcje wielosubstratowe można podzielić na dwie klasy: sekwencyjne wypieranie i podwójne wypieranie.

Sekwencyjne wypieranie

W mechanizmie sekwencyjnym, wszystkie substraty muszą związać się z enzymem zanim zostanie uwolniony jakikolwiek produkt. W konsekwencji, w reakcji bisubstratowej, tworzy się trójskładnikowy kompleks enzymu i obu substratów. Mechanizmy sekwencyjne są dwojakiego rodzaju: uporządkowane, w których substraty wiążą się z enzymem w określonej kolejności, oraz przypadkowe.

Wiele enzymów, których substratem jest NAD+ lub NADH, wykazuje mechanizm sekwencyjny uporządkowany. Rozważmy dehydrogenazę mleczanową, ważny enzym w metabolizmie glukozy (Rozdział 16.1.9). Enzym ten redukuje pirogronian do mleczanu, jednocześnie utleniając NADH do NAD+.

W uporządkowanym mechanizmie sekwencyjnym, koenzym zawsze wiąże się jako pierwszy i mleczan jest zawsze uwalniany jako pierwszy. Sekwencję tę można przedstawić w następujący sposób w notacji opracowanej przez W. Wallace Clelanda:

Ezym istnieje jako kompleks trójskładnikowy: najpierw składający się z enzymu i substratów, a po katalizie z enzymu i produktów.

W mechanizmie sekwencyjnym losowym kolejność dodawania substratów i uwalniania produktów jest przypadkowa. Sekwencyjne reakcje losowe ilustruje powstawanie fosfokreatyny i ADP z ATP i kreatyny, reakcja katalizowana przez kinazę kreatynową (podrozdział 14.1.5).

Fosfokreatyna jest ważnym źródłem energii w mięśniach. Sekwencyjne reakcje losowe można również przedstawić w notacji Clelanda.

Ale chociaż kolejność pewnych zdarzeń jest losowa, reakcja nadal przechodzi przez kompleksy trójskładnikowe zawierające, najpierw, substraty, a następnie, produkty.

Reakcje podwójnego przemieszczenia (Ping-Pong)

W reakcjach podwójnego przemieszczenia, lub Ping-Pong, jeden lub więcej produktów jest uwalnianych zanim wszystkie substraty zwiążą enzym. Cechą charakterystyczną reakcji podwójnego przemieszczenia jest istnienie podstawionego enzymu pośredniego, w którym enzym jest tymczasowo zmodyfikowany. Reakcje, które przenoszą grupy aminowe pomiędzy aminokwasami i α-ketokwasami są klasycznymi przykładami mechanizmów podwójnego przemieszczenia. Enzym aminotransferaza asparaginianowa (rozdział 23.3.1) katalizuje przeniesienie grupy aminowej z asparaginianu do α-ketoglutaranu.

Sekwencję zdarzeń można przedstawić na poniższym schemacie.

Po tym jak asparaginian zwiąże się z enzymem, enzym usuwa grupę aminową asparaginianu, tworząc podstawiony enzym pośredni. Pierwszy produkt, oxaloacetate, następnie odchodzi. Drugi substrat, α-ketoglutaran, wiąże się z enzymem, przyjmuje grupę aminową ze zmodyfikowanego enzymu, a następnie jest uwalniany jako produkt końcowy, glutaminian. W zapisie Cleland, substraty wydają się odbijać od i na enzymie analogicznie do piłeczki Ping-Pong odbijającej się na stole.

8.4.4. Allosteric Enzymes Do Not Obey Michaelis-Menten Kinetics

Model Michaelisa-Mentena bardzo wspomógł rozwój chemii enzymatycznej. Jego zaletą jest prostota i szeroka możliwość zastosowania. Jednakże, model Michaelisa-Mentena nie jest w stanie opisać właściwości kinetycznych wielu enzymów. Ważną grupę enzymów, które nie podlegają kinetyce Michaelisa-Mentena, stanowią enzymy allosteryczne. Enzymy te składają się z wielu podjednostek i wielu miejsc aktywnych.

Allosteryczne enzymy często wykazują wykresy sigmoidalne (Rysunek 8.14) prędkości reakcji V0 względem stężenia substratu , zamiast wykresów hiperbolicznych przewidywanych przez równanie Michaelisa-Mentena (równanie 23). W enzymach allosterycznych, wiązanie substratu do jednego miejsca aktywnego może wpływać na właściwości innych miejsc aktywnych w tej samej cząsteczce enzymu. Możliwym wynikiem tej interakcji między podjednostkami jest to, że wiązanie substratu staje się kooperatywne; to znaczy, wiązanie substratu do jednego miejsca aktywnego enzymu ułatwia wiązanie substratu do innych miejsc aktywnych. Jak zostanie to rozważone w rozdziale 10, taka kooperatywność skutkuje sigmoidalnym wykresem V0 w stosunku do . Ponadto, aktywność enzymu allosterycznego może być zmieniana przez cząsteczki regulacyjne, które są odwracalnie związane z określonymi miejscami, innymi niż miejsca katalityczne. W ten sposób właściwości katalityczne enzymów allosterycznych mogą być dostosowane do bezpośrednich potrzeb komórki (Rozdział 10). Z tego powodu enzymy allosteryczne są kluczowymi regulatorami szlaków metabolicznych w komórce.

Rysunek 8.14

Kinetyka dla enzymu allosterycznego. Enzymy allosteryczne wykazują sigmoidalną zależność szybkości reakcji od stężenia substratu.