La función principal de las enzimas es aumentar la velocidad de las reacciones para que sean compatibles con las necesidades del organismo. Para entender cómo funcionan las enzimas, necesitamos una descripción cinética de su actividad. Para muchas enzimas, la tasa de catálisis V0, que se define como el número de moles de producto formados por segundo, varía con la concentración de sustrato de la manera mostrada en la figura 8.11. La tasa de catálisis aumenta linealmente a medida que se incrementa la concentración de sustrato y, a continuación, comienza a nivelarse y a acercarse a un máximo a concentraciones de sustrato más elevadas. Antes de poder interpretar con precisión este gráfico, debemos entender cómo se genera. Considere una enzima que cataliza la transformación de S en P por la siguiente vía:
- Figura 8.11
- Figura 8.12
- Figura 8.13
- 8.4.1. Significado de la KM y la V La importancia de los valores KM y Vmax
- Precisiones conceptuales, cinética enzimática en estado estacionario
- Tabla 8.5
- Tabla 8.6
- 8.4.2. La perfección cinética en la catálisis enzimática: El criterio kcat/KM
- Tabla 8.7
- Efecto Circe-
- Tabla 8.8
- 8.4.3. La mayoría de las reacciones bioquímicas incluyen múltiples sustratos
- Desplazamiento secuencial
- Reacciones de doble desplazamiento (Ping-Pong)
- 8.4.4. Las enzimas alostéricas no obedecen a la cinética de Michaelis-Menten
- Figura 8.14
Figura 8.11
Cinética de Michaelis-Menten. Un gráfico de la velocidad de reacción (V0) en función de la concentración de sustrato para una enzima que obedece a la cinética de Michaelis-Menten muestra que la velocidad máxima (Vmax) se aproxima asintóticamente. La constante de Michaelis (más…)
La extensión de la formación del producto se determina en función del tiempo para una serie de concentraciones de sustrato (Figura 8.12). Como se esperaba, en cada caso, la cantidad de producto formado aumenta con el tiempo, aunque finalmente se alcanza un momento en el que no hay ningún cambio neto en la concentración de S o P. La enzima sigue convirtiendo activamente el sustrato en producto y viceversa, pero se ha alcanzado el equilibrio de la reacción. La figura 8.13A ilustra los cambios de concentración observados en todos los participantes de la reacción con el tiempo hasta que se ha alcanzado el equilibrio.
Figura 8.12
Determinación de la velocidad inicial. La cantidad de producto formado a diferentes concentraciones de sustrato se traza en función del tiempo. La velocidad inicial (V0) para cada concentración de sustrato se determina a partir de la pendiente de la curva al principio de (mas…)
Figura 8.13
Cambios en la concentración de los participantes de una reacción catalizada por enzimas con el tiempo. Cambios de concentración bajo (A) condiciones de estado estacionario, y (B) las condiciones de pre-estado estacionario.
La cinética enzimática es más fácil de abordar si podemos ignorar la reacción posterior. Definimos V0 como la tasa de aumento del producto con el tiempo cuando es baja; es decir, en tiempos cercanos a cero (por lo tanto, V0) (Figura 8.13B). Así, para la gráfica de la figura 8.11, V0 se determina para cada concentración de sustrato midiendo la velocidad de formación de producto en los primeros momentos antes de que se acumule P (véase la figura 8.12).
Empezamos nuestro examen cinético de la actividad enzimática con la gráfica mostrada en la figura 8.11. A una concentración fija de enzima, V0 es casi linealmente proporcional a cuando es pequeño pero es casi independiente de cuando es grande. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten propusieron un modelo sencillo para explicar estas características cinéticas. La característica crítica en su tratamiento es que un complejo ES específico es un intermedio necesario en la catálisis. El modelo propuesto, que es el más sencillo que da cuenta de las propiedades cinéticas de muchas enzimas, es
Una enzima E se combina con el sustrato S para formar un complejo ES, con una constante de velocidad k1. El complejo ES tiene dos destinos posibles. Puede disociarse a E y S, con una constante de velocidad k-1, o puede proceder a formar el producto P, con una constante de velocidad k2. De nuevo, suponemos que casi nada del producto revierte al sustrato inicial, una condición que se da en la etapa inicial de una reacción antes de que la concentración de producto sea apreciable.
Queremos una expresión que relacione la tasa de catálisis con las concentraciones de sustrato y enzima y las tasas de los pasos individuales. Nuestro punto de partida es que la tasa catalítica es igual al producto de la concentración del complejo ES y k2.
Ahora necesitamos expresar en términos de cantidades conocidas. Las tasas de formación y descomposición de ES vienen dadas por:
Para simplificar las cosas, trabajaremos bajo la hipótesis de estado estacionario. En un estado estacionario, las concentraciones de los productos intermedios, en este caso, permanecen iguales aunque las concentraciones de los materiales de partida y de los productos cambien. Esto ocurre cuando las tasas de formación y descomposición del complejo ES son iguales. Al igualar los lados derechos de las ecuaciones 11 y 12 se obtiene
Al reordenar la ecuación 13, obtenemos
La ecuación 14 puede simplificarse definiendo una nueva constante, KM, llamada constante de Michaelis:
Nótese que KM tiene las unidades de concentración. La KM es una característica importante de las interacciones enzima-sustrato y es independiente de las concentraciones de enzima y sustrato.
Insertando la ecuación 15 en la ecuación 14 y resolviendo los rendimientos
Ahora examinemos el numerador de la ecuación 16. La concentración de sustrato no combinado es casi igual a la concentración total de sustrato, siempre que la concentración de enzima sea mucho menor que la de sustrato. La concentración de enzima no combinada es igual a la concentración total de enzima T menos la concentración del complejo ES.
Sustituyendo esta expresión para en la ecuación 16 se obtiene
Resolviendo la ecuación 18 para se obtiene
o
Al sustituir esta expresión para en la ecuación 10, obtenemos
La velocidad máxima, Vmax, se alcanza cuando los sitios catalíticos de la enzima están saturados de sustrato, es decir, cuando = T. Así,
Sustituyendo la ecuación 22 en la ecuación 21 se obtiene la ecuación de Michaelis-Menten:
Esta ecuación explica los datos cinéticos de la figura 8.11. A una concentración de sustrato muy baja, cuando es mucho menor que KM, V0 = (Vmax/KM); es decir, la velocidad es directamente proporcional a la concentración de sustrato. A alta concentración de sustrato, cuando es mucho mayor que KM, V0 = Vmax; es decir, la tasa es máxima, independiente de la concentración de sustrato.
El significado de KM es evidente a partir de la ecuación 23. Cuando = KM, entonces V0 = Vmax/2. Por tanto, KM es igual a la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad de su valor máximo. La KM es una característica importante de una reacción catalizada por una enzima y es significativa para su función biológica.
La consecuencia fisiológica de la KM queda ilustrada por la sensibilidad de algunos individuos al etanol. Estas personas presentan enrojecimiento facial y aceleración del ritmo cardíaco (taquicardia) después de ingerir incluso pequeñas cantidades de alcohol. En el hígado, la alcohol deshidrogenasa convierte el etanol en acetaldehído.
Normalmente, el acetaldehído, que es la causa de los síntomas cuando está presente en altas concentraciones, es procesado a acetato por la acetaldehído deshidrogenasa.
La mayoría de las personas tienen dos formas de la acetaldehído deshidrogenasa, una forma mitocondrial de bajo KM y una forma citosólica de alto KM. En las personas susceptibles, la enzima mitocondrial es menos activa debido a la sustitución de un solo aminoácido, y el acetaldehído es procesado únicamente por la enzima citosólica. Debido a que esta enzima tiene un KM elevado, se convierte menos acetaldehído en acetato; el exceso de acetaldehído se escapa a la sangre y es el responsable de los efectos fisiológicos.
8.4.1. Significado de la KM y la V La importancia de los valores KM y Vmax
Precisiones conceptuales, cinética enzimática en estado estacionario
Aprenda cómo se pueden determinar experimentalmente los parámetros cinéticos KMy Vmax utilizando la simulación de laboratorio de cinética enzimática en este módulo multimedia.
La constante de Michaelis, KM, y la tasa máxima, Vmax, pueden derivarse fácilmente de las tasas de catálisis medidas a una variedad de concentraciones de sustrato si una enzima opera según el esquema simple dado en la ecuación 23. La derivación de KM y Vmáx se consigue más comúnmente con el uso de programas de ajuste de curvas en un ordenador (véase el apéndice de este capítulo para medios alternativos de determinación de KM y Vmáx). Los valores de KM de las enzimas varían mucho (Tabla 8.5). Para la mayoría de las enzimas, la KM se sitúa entre 10-1 y 10-7 M. El valor de KM para una enzima depende del sustrato concreto y de las condiciones ambientales, como el pH, la temperatura y la fuerza iónica. La constante de Michaelis, KM, tiene dos significados. En primer lugar, KM es la concentración de sustrato a la que se llena la mitad de los sitios activos. Así, la KM proporciona una medida de la concentración de sustrato necesaria para que se produzca una catálisis significativa. De hecho, para muchas enzimas, la evidencia experimental sugiere que el KM proporciona una aproximación a la concentración de sustrato in vivo. Cuando se conoce el KM, la fracción de sitios llenos, fES, a cualquier concentración de sustrato puede calcularse a partir de
Tabla 8.5
Valores de KM de algunas enzimas.
En segundo lugar, el KM está relacionado con las constantes de velocidad de los pasos individuales en el esquema catalítico dado en la ecuación 9. En la ecuación 15, KM se define como (k-1 + k2)/k1. Consideremos un caso límite en el que k-1 es mucho mayor que k2. En tales circunstancias, el complejo ES se disocia a E y S mucho más rápidamente de lo que se forma el producto. En estas condiciones (k-1 >> k2),
La constante de disociación del complejo ES viene dada por
En otras palabras, KM es igual a la constante de disociación del complejo ES si k2 es mucho menor que k-1. Cuando se cumple esta condición, la KM es una medida de la fuerza del complejo ES: una KM alta indica una unión débil; una KM baja indica una unión fuerte. Debe subrayarse que KM indica la afinidad del complejo ES sólo cuando k-1 es mucho mayor que k2.
La tasa máxima, Vmax, revela el número de recambio de una enzima, que es el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por una molécula de enzima en una unidad de tiempo cuando la enzima está totalmente saturada de sustrato. Es igual a la constante cinética k2, también llamada kcat. La tasa máxima, Vmax, revela el número de recambio de una enzima si se conoce la concentración de sitios activos T, porque
y por tanto
Por ejemplo, una solución 10-6 M de anhidrasa carbónica cataliza la formación de 0,6 M de H2CO3 por segundo cuando está totalmente saturada de sustrato. Por lo tanto, k2 es 6 × 105 s-1. Este número de recambio es uno de los mayores conocidos. Cada reacción catalizada tiene lugar en un tiempo igual a 1/k2, que es de 1,7 μs para la anhidrasa carbónica. Los números de recambio de la mayoría de las enzimas con sus sustratos fisiológicos caen en el rango de 1 a 104 por segundo (Tabla 8.6).
Tabla 8.6
Números máximos de recambio de algunas enzimas.
8.4.2. La perfección cinética en la catálisis enzimática: El criterio kcat/KM
Cuando la concentración de sustrato es mucho mayor que KM, la velocidad de catálisis es igual a kcat, el número de recambio, como se describe en la sección 8.4.1. Sin embargo, la mayoría de las enzimas no están normalmente saturadas de sustrato. En condiciones fisiológicas, la relación /KM suele estar entre 0,01 y 1,0. Cuando << KM, la tasa enzimática es mucho menor que kcat porque la mayoría de los sitios activos están desocupados. ¿Existe un número que caracterice la cinética de una enzima en estas condiciones celulares más típicas? De hecho, lo hay, como puede demostrarse combinando las ecuaciones 10 y 16 para dar
Cuando << KM, la concentración de enzima libre, , es casi igual a la concentración total de enzima , por lo que
Así, cuando << KM, la velocidad enzimática depende de los valores de kcat/KM, , y T. En estas condiciones, kcat/KM es la constante de velocidad para la interacción de S y E y puede utilizarse como medida de la eficiencia catalítica. Por ejemplo, utilizando los valores de kcat/KM, se puede comparar la preferencia de una enzima por diferentes sustratos. La Tabla 8.7 muestra los valores de kcat/KM para varios sustratos diferentes de la quimotripsina (Sección 9.1.1). La quimotripsina tiene claramente una preferencia por escindir junto a cadenas laterales voluminosas e hidrofóbicas.
Tabla 8.7
Preferencias de sustrato de la quimotripsina.
¿Cuán eficiente puede ser una enzima? Podemos abordar esta pregunta determinando si hay algún límite físico en el valor de kcat/KM. Obsérvese que esta relación depende de k1, k-1 y kcat, como puede demostrarse sustituyendo por KM.
Supongamos que la velocidad de formación de producto (kcat) es mucho más rápida que la velocidad de disociación del complejo ES (k-1). El valor de kcat/KM se aproxima entonces a k1. Por lo tanto, el límite final del valor de kcat/KM lo establece k1, la velocidad de formación del complejo ES. Esta tasa no puede ser más rápida que el encuentro controlado por difusión de una enzima y su sustrato. La difusión limita el valor de k1 de manera que no puede ser superior a entre 108 y 109 s-1 M-1. Por lo tanto, el límite superior de kcat/KM está entre 108 y 109 s-1 M-1.
Las relaciones kcat/KM de las enzimas superóxido dismutasa, acetilcolinesterasa y triosa fosfato isomerasa están entre 108 y 109 s-1 M-1. Las enzimas que tienen relaciones kcat/KM en los límites superiores han alcanzado la perfección cinética. Su velocidad catalítica está restringida únicamente por la velocidad a la que encuentran el sustrato en la solución (Tabla 8.8). Cualquier otra ganancia en la velocidad catalítica sólo puede venir por la disminución del tiempo de difusión. Recuerde que el sitio activo es sólo una pequeña parte de la estructura total de la enzima. Sin embargo, para las enzimas catalíticamente perfectas, cada encuentro entre la enzima y el sustrato es productivo. En estos casos, puede haber fuerzas electrostáticas atractivas en la enzima que atraigan al sustrato al sitio activo. Estas fuerzas a veces se denominan poéticamente efectos Circe.
Efecto Circe-
La utilización de fuerzas atractivas para atraer a un sustrato a un sitio en el que sufre una transformación de la estructura, según la definición de William P. Jencks, un enzimólogo, que acuñó el término.
Una diosa de la mitología griega, Circe, atrajo a los hombres de Odiseo a su casa y luego los transformó en cerdos.
Tabla 8.8
Enzimas para las que kcat/KM está cerca de la tasa de encuentro controlada por difusión.
El límite impuesto por la velocidad de difusión en solución también puede superarse en parte confinando sustratos y productos en el volumen limitado de un complejo multienzimático. De hecho, algunas series de enzimas se asocian en conjuntos organizados (Sección 17.1.9) de modo que el producto de una enzima es encontrado muy rápidamente por la siguiente enzima. En efecto, los productos se canalizan de una enzima a la siguiente, como en una cadena de montaje.
8.4.3. La mayoría de las reacciones bioquímicas incluyen múltiples sustratos
La mayoría de las reacciones en los sistemas biológicos suelen incluir dos sustratos y dos productos y pueden representarse mediante la reacción de bisustrato:
La mayoría de estas reacciones implican la transferencia de un grupo funcional, como un grupo fosforilo o amonio, de un sustrato a otro. En las reacciones de oxidación-reducción, los electrones se transfieren entre sustratos. Las reacciones de sustrato múltiple pueden dividirse en dos clases: desplazamiento secuencial y doble desplazamiento.
Desplazamiento secuencial
En el mecanismo secuencial, todos los sustratos deben unirse a la enzima antes de que se libere cualquier producto. En consecuencia, en una reacción de bisustrato, se forma un complejo ternario de la enzima y ambos sustratos. Los mecanismos secuenciales son de dos tipos: ordenados, en los que los sustratos se unen a la enzima en una secuencia definida, y aleatorios.
Muchas enzimas que tienen NAD+ o NADH como sustrato muestran el mecanismo secuencial ordenado. Considere la lactato deshidrogenasa, una enzima importante en el metabolismo de la glucosa (Sección 16.1.9). Esta enzima reduce el piruvato a lactato mientras oxida el NADH a NAD+.
En el mecanismo secuencial ordenado, la coenzima siempre se une primero y el lactato siempre se libera primero. Esta secuencia puede representarse como sigue en una notación desarrollada por W. Wallace Cleland:
La enzima existe como un complejo ternario: primero, formado por la enzima y los sustratos y, después de la catálisis, la enzima y los productos.
En el mecanismo secuencial aleatorio, el orden de adición de los sustratos y de liberación de los productos es aleatorio. Las reacciones aleatorias secuenciales se ilustran con la formación de fosfocreatina y ADP a partir de ATP y creatina, una reacción catalizada por la creatina quinasa (Sección 14.1.5).
La fosfocreatina es una importante fuente de energía en el músculo. Las reacciones aleatorias secuenciales también pueden representarse en la notación de Cleland.
Aunque el orden de ciertos eventos es aleatorio, la reacción sigue pasando por los complejos ternarios que incluyen, primero, sustratos y, después, productos.
Reacciones de doble desplazamiento (Ping-Pong)
En las reacciones de doble desplazamiento, o Ping-Pong, uno o más productos se liberan antes de que todos los sustratos se unan a la enzima. La característica que define las reacciones de doble desplazamiento es la existencia de un intermedio enzimático sustituido, en el que la enzima se modifica temporalmente. Las reacciones que intercambian grupos amino entre aminoácidos y α-cetoácidos son ejemplos clásicos de mecanismos de doble desplazamiento. La enzima aspartato aminotransferasa (Sección 23.3.1) cataliza la transferencia de un grupo amino del aspartato al α-cetoglutarato.
La secuencia de acontecimientos puede representarse en el siguiente diagrama.
Después de que el aspartato se une a la enzima, ésta elimina el grupo amino del aspartato para formar el intermedio enzimático sustituido. El primer producto, el oxaloacetato, sale posteriormente. El segundo sustrato, el α-cetoglutarato, se une a la enzima, acepta el grupo amino de la enzima modificada y se libera como producto final, el glutamato. En la notación de Cleland, los sustratos parecen rebotar en la enzima de forma análoga a una pelota de ping-pong que rebota en una mesa.
8.4.4. Las enzimas alostéricas no obedecen a la cinética de Michaelis-Menten
El modelo de Michaelis-Menten ha ayudado mucho al desarrollo de la química enzimática. Sus virtudes son la simplicidad y la amplia aplicabilidad. Sin embargo, el modelo de Michaelis-Menten no puede dar cuenta de las propiedades cinéticas de muchas enzimas. Un grupo importante de enzimas que no obedecen a la cinética de Michaelis-Menten son las enzimas alostéricas. Estas enzimas constan de múltiples subunidades y múltiples sitios activos.
Las enzimas alostéricas suelen mostrar gráficos sigmoidales (Figura 8.14) de la velocidad de reacción V0 frente a la concentración de sustrato, en lugar de los gráficos hiperbólicos predichos por la ecuación de Michaelis-Menten (ecuación 23). En las enzimas alostéricas, la unión del sustrato a un sitio activo puede afectar a las propiedades de otros sitios activos de la misma molécula enzimática. Un posible resultado de esta interacción entre subunidades es que la unión del sustrato se vuelve cooperativa; es decir, la unión del sustrato a un sitio activo de la enzima facilita la unión del sustrato a los otros sitios activos. Como se estudiará en el capítulo 10, dicha cooperatividad da lugar a un gráfico sigmoidal de V0 frente a . Además, la actividad de una enzima alostérica puede verse alterada por moléculas reguladoras que se unen reversiblemente a sitios específicos distintos de los sitios catalíticos. Así, las propiedades catalíticas de las enzimas alostéricas pueden ajustarse para satisfacer las necesidades inmediatas de una célula (capítulo 10). Por esta razón, las enzimas alostéricas son reguladores clave de las vías metabólicas en la célula.
Figura 8.14
Cinética de una enzima alostérica. Las enzimas alostéricas muestran una dependencia sigmoidal de la velocidad de reacción con respecto a la concentración de sustrato.