Bookshelf

by admin Leave Comment

De belangrijkste functie van enzymen is het opvoeren van reactiesnelheden zodat deze verenigbaar zijn met de behoeften van het organisme. Om te begrijpen hoe enzymen functioneren, hebben we een kinetische beschrijving van hun activiteit nodig. Voor veel enzymen varieert de katalysesnelheid V0, die wordt gedefinieerd als het aantal mol gevormd product per seconde, met de substraatconcentratie op de in figuur 8.11 aangegeven wijze. De katalysesnelheid neemt lineair toe naarmate de substraatconcentratie toeneemt en begint dan af te vlakken en een maximum te bereiken bij hogere substraatconcentraties. Voordat we deze grafiek nauwkeurig kunnen interpreteren, moeten we begrijpen hoe hij tot stand komt. Beschouw een enzym dat de S naar P katalyseert via de volgende route:

De mate van productvorming wordt bepaald als functie van de tijd voor een reeks van substraatconcentraties (figuur 8.12). Zoals verwacht neemt in elk geval de hoeveelheid gevormd product toe met de tijd, hoewel uiteindelijk een tijdstip wordt bereikt waarop de concentratie van S of P netto niet meer verandert. Het enzym zet nog steeds actief substraat om in product en vice versa, maar het reactie-evenwicht is bereikt. Figuur 8.13A illustreert de veranderingen in concentratie die in alle deelnemers aan de reactie worden waargenomen met de tijd totdat een evenwicht is bereikt.

Figuur 8.12

Bepaling van de beginsnelheid. De hoeveelheid product die bij verschillende substraatconcentraties wordt gevormd, wordt uitgezet als functie van de tijd. De beginsnelheid (V0) voor elke substraatconcentratie wordt bepaald uit de helling van de curve aan het begin van (meer…)

Figuur 8.13

Veranderingen in de concentratie van de deelnemers aan een enzym-gekatalyseerde reactie in de tijd. Concentratieveranderingen onder (A) steady-state condities, en (B) de pre-steady-state condities.

Enzymkinetiek is gemakkelijker te benaderen als we de terugreactie kunnen negeren. We definiëren V0 als de snelheid waarmee het product toeneemt met de tijd wanneer deze laag is; dat wil zeggen, op momenten dicht bij nul (vandaar V0) (figuur 8.13B). Voor de grafiek in figuur 8.11 wordt V0 dus voor elke substraatconcentratie bepaald door de snelheid van productvorming te meten op vroege tijdstippen voordat P zich ophoopt (zie figuur 8.12).

We beginnen ons kinetisch onderzoek van de enzymactiviteit met de grafiek in figuur 8.11. Bij een vaste concentratie enzym is V0 bijna lineair evenredig met wanneer klein is, maar bijna onafhankelijk van wanneer groot is. In 1913 stelden Leonor Michaelis en Maud Menten een eenvoudig model voor om deze kinetische karakteristieken te verklaren. Het kritische kenmerk in hun behandeling is dat een specifiek ES-complex een noodzakelijk tussenproduct is in de katalyse. Het voorgestelde model, dat het eenvoudigste is dat de kinetische eigenschappen van veel enzymen verklaart, is

Een enzym E verbindt zich met substraat S tot een ES-complex, met een snelheidsconstante k1. Het ES-complex heeft twee mogelijke lotgevallen. Het kan dissociëren tot E en S, met een snelheidsconstante k-1, of het kan overgaan tot de vorming van product P, met een snelheidsconstante k2. Ook hier nemen we aan dat vrijwel niets van het product weer in het oorspronkelijke substraat terechtkomt, een voorwaarde die geldt in het beginstadium van een reactie voordat de concentratie van het product merkbaar is.

We willen een uitdrukking die de snelheid van de katalyse relateert aan de concentraties van substraat en enzym en aan de snelheden van de afzonderlijke stappen. Ons uitgangspunt is dat de katalytische snelheid gelijk is aan het product van de concentratie van het ES-complex en k2.

Nu moeten we dit uitdrukken in termen van bekende grootheden. De snelheid van vorming en afbraak van ES wordt gegeven door:

Om de zaken te vereenvoudigen, gaan we uit van een stationaire toestand. In een stationaire toestand blijven de concentraties van de tussenproducten, in dit geval , gelijk, ook al veranderen de concentraties van de uitgangsstoffen en de producten. Dit gebeurt wanneer de snelheid van vorming en afbraak van het ES-complex gelijk zijn. Wanneer we de rechterzijden van vergelijkingen 11 en 12 gelijkstellen, krijgen we

Door vergelijking 13 te herschikken, krijgen we

Vergelijking 14 kan worden vereenvoudigd door een nieuwe constante te definiëren, KM, die de Michaelis-constante wordt genoemd:

Merk op dat KM de eenheden van concentratie heeft. KM is een belangrijke eigenschap van enzym-substraat interacties en is onafhankelijk van enzym- en substraatconcentraties.

Invoegen van vergelijking 15 in vergelijking 14 en oplossen voor levert

Laten we nu de teller van vergelijking 16 onderzoeken. De concentratie van het ongebundelde substraat is vrijwel gelijk aan de totale substraatconcentratie, mits de concentratie van het enzym veel lager is dan die van het substraat. De concentratie van het ongebundelde enzym is gelijk aan de totale enzymconcentratie T minus de concentratie van het ES-complex.

Substitueren van deze uitdrukking voor in vergelijking 16 geeft

Oplossen van vergelijking 18 voor geeft

of

Door substitueren van deze uitdrukking voor in vergelijking 10, verkrijgen we

De maximale snelheid, Vmax, wordt bereikt wanneer de katalytische plaatsen op het enzym verzadigd zijn met substraat, d.w.z. wanneer = T.

Substitutie van vergelijking 22 in vergelijking 21 levert de Michaelis-Menten-vergelijking op:

Deze vergelijking is de verklaring voor de kinetische gegevens in figuur 8.11. Bij zeer lage substraatconcentratie, wanneer deze veel lager is dan KM, is V0 = (Vmax/KM); dit wil zeggen dat de snelheid recht evenredig is met de substraatconcentratie. Bij hoge substraatconcentratie, wanneer deze veel groter is dan KM, is V0 = Vmax; dat wil zeggen dat de snelheid maximaal is, onafhankelijk van de substraatconcentratie.

De betekenis van KM blijkt duidelijk uit vergelijking 23. Wanneer = KM, dan is V0 = Vmax/2. KM is dus gelijk aan de substraatconcentratie waarbij de reactiesnelheid de helft van zijn maximale waarde bedraagt. KM is een belangrijke eigenschap van een enzym-gekatalyseerde reactie en is van belang voor de biologische functie ervan.

Het fysiologische gevolg van KM wordt geïllustreerd door de gevoeligheid van sommige personen voor ethanol. Zulke personen vertonen een blozend gezicht en een snelle hartslag (tachycardie) na inname van zelfs kleine hoeveelheden alcohol. In de lever wordt ethanol door alcoholdehydrogenase omgezet in acetaldehyde.

Normaal wordt het acetaldehyde, dat bij hoge concentraties de oorzaak van de symptomen is, door acetaldehyde-dehydrogenase tot acetaat verwerkt.

De meeste mensen hebben twee vormen van het acetaldehyde-dehydrogenase, een lage KM mitochondriale vorm en een hoge KM cytosolische vorm. Bij gevoelige personen is het mitochondriale enzym minder actief door de substitutie van een enkel aminozuur, en wordt acetaldehyde alleen door het cytosolische enzym verwerkt. Omdat dit enzym een hoge KM heeft, wordt minder aceetaldehyde omgezet in acetaat; een teveel aan aceetaldehyde ontsnapt in het bloed en is verantwoordelijk voor de fysiologische effecten. De betekenis van KM- en Vmax-waarden

Conceptuele inzichten, Steady-State Enzymkinetiek

Leer hoe de kinetische parameters KMen Vmax experimenteel kunnen worden bepaald met behulp van de labsimulatie van de enzymkinetiek in deze mediamodule.

De Michaelis-constante, KM, en de maximale snelheid, Vmax, kunnen gemakkelijk worden afgeleid uit de katalysatiesnelheden die bij verschillende substraatconcentraties zijn gemeten, als een enzym volgens het eenvoudige schema van vergelijking 23 werkt. De afleiding van KM en Vmax gebeurt meestal met behulp van curve-fittingprogramma’s op een computer (zie de bijlage bij dit hoofdstuk voor alternatieve methoden om KM en Vmax te bepalen). De KM-waarden van enzymen lopen sterk uiteen (tabel 8.5). Voor de meeste enzymen ligt KM tussen 10-1 en 10-7 M. De KM-waarde voor een enzym hangt af van het specifieke substraat en van omgevingsfactoren zoals pH, temperatuur en ionensterkte. De Michaelis-constante, KM, heeft twee betekenissen. Ten eerste is KM de concentratie van het substraat waarbij de helft van de actieve sites gevuld is. De KM is dus een maat voor de substraatconcentratie die nodig is om een significante katalyse te laten plaatsvinden. Voor veel enzymen is experimenteel aangetoond dat KM een benadering geeft van de substraatconcentratie in vivo. Wanneer de KM bekend is, kan de fractie van de gevulde plaatsen, fES, bij elke substraatconcentratie worden berekend uit

Tabel 8.5

KM-waarden van enkele enzymen.

Ten tweede is KM gerelateerd aan de snelheidsconstanten van de afzonderlijke stappen in het katalytische schema, gegeven in vergelijking 9. In vergelijking 15 is KM gedefinieerd als (k-1 + k2)/k1. Beschouw een beperkend geval waarin k-1 veel groter is dan k2. In dat geval dissocieert het ES-complex veel sneller tot E en S dan dat er product wordt gevormd. Onder deze omstandigheden (k-1 >> k2),

De dissociatieconstante van het ES-complex wordt gegeven door

Met andere woorden, KM is gelijk aan de dissociatieconstante van het ES-complex als k2 veel kleiner is dan k-1. Als aan deze voorwaarde is voldaan, is KM een maat voor de sterkte van het ES-complex: een hoge KM wijst op een zwakke binding; een lage KM wijst op een sterke binding. Benadrukt moet worden dat KM alleen iets zegt over de affiniteit van het ES-complex wanneer k-1 veel groter is dan k2.

De maximale snelheid, Vmax, geeft het omzetgetal van een enzym aan, dat het aantal substraatmoleculen is dat door een enzymmolecuul in een tijdseenheid in product wordt omgezet wanneer het enzym volledig verzadigd is met substraat. Het is gelijk aan de kinetische constante k2, die ook kcat wordt genoemd. De maximale snelheid, Vmax, geeft het omzetcijfer van een enzym aan als de concentratie van de actieve sites T bekend is, omdat

en dus

Bij voorbeeld, een 10-6 M oplossing van koolzuuranhydrase katalyseert de vorming van 0,6 M H2CO3 per seconde wanneer het volledig verzadigd is met substraat. Vandaar dat k2 6 × 105 s-1 is. Dit omzetgetal is een van de grootste die bekend zijn. Elke gekatalyseerde reactie vindt plaats in een tijd die gelijk is aan 1/k2, wat voor koolzuuranhydrase neerkomt op 1,7 μs. De omzetgetallen van de meeste enzymen met hun fysiologische substraten liggen in het bereik van 1 tot 104 per seconde (tabel 8.6).

Tabel 8.6

Maximale omzetgetallen van sommige enzymen.

8.4.2. Kinetische perfectie in enzymatische katalyse: Het kcat/KM-criterium

Wanneer de substraatconcentratie veel groter is dan KM, is de katalysatiesnelheid gelijk aan kcat, het omzetgetal, zoals beschreven in paragraaf 8.4.1. De meeste enzymen zijn echter normaal gesproken niet verzadigd met substraat. Onder fysiologische omstandigheden ligt de verhouding /KM gewoonlijk tussen 0,01 en 1,0. Wanneer << KM, is de enzymsnelheid veel lager dan kcat omdat de meeste actieve sites onbezet zijn. Is er een getal dat de kinetiek van een enzym onder deze meer typische cellulaire omstandigheden karakteriseert? Dat is inderdaad het geval, zoals blijkt uit de combinatie van vergelijkingen 10 en 16:

Wanneer << KM, is de concentratie vrij enzym, , bijna gelijk aan de totale concentratie enzym , dus

T Wanneer << KM, hangt de enzymsnelheid dus af van de waarden van kcat/KM, , en T. Onder deze omstandigheden is kcat/KM de snelheidsconstante voor de interactie tussen S en E en kan deze worden gebruikt als maat voor de katalytische efficiëntie. Met behulp van kcat/KM-waarden kan bijvoorbeeld de voorkeur van een enzym voor verschillende substraten worden vergeleken. Tabel 8.7 toont de kcat/KM-waarden voor verschillende substraten van chymotrypsine (paragraaf 9.1.1). Chymotrypsine heeft duidelijk een voorkeur voor splitsing naast volumineuze, hydrofobe zijketens.

Tabel 8.7

Substraatvoorkeuren van chymotrypsine.

Hoe efficiënt kan een enzym zijn? We kunnen deze vraag benaderen door na te gaan of er fysische grenzen zijn aan de waarde van kcat/KM. Merk op dat deze verhouding afhangt van k1, k-1 en kcat, zoals kan worden aangetoond door KM te vervangen.

Vergonderstel dat de snelheid waarmee het product wordt gevormd (kcat) veel sneller is dan de snelheid waarmee het ES-complex uiteenvalt (k-1). De waarde van kcat/KM benadert dan k1. De uiterste limiet voor de waarde van kcat/KM wordt dus bepaald door k1, de snelheid waarmee het ES-complex wordt gevormd. Deze snelheid kan niet sneller zijn dan de diffusiegecontroleerde ontmoeting van een enzym en zijn substraat. Diffusie beperkt de waarde van k1 zodat deze niet hoger kan zijn dan tussen 108 en 109 s-1 M-1. Daarom ligt de bovengrens van kcat/KM tussen 108 en 109 s-1 M-1.

De kcat/KM-verhoudingen van de enzymen superoxide-dismutase, acetylcholinesterase en triosefosfaatisomerase liggen tussen 108 en 109 s-1 M-1. Enzymen zoals deze, die kcat/KM-verhoudingen aan de bovengrens hebben, hebben een kinetische perfectie bereikt. Hun katalytische snelheid wordt alleen beperkt door de snelheid waarmee zij substraat in de oplossing aantreffen (tabel 8.8). Een verdere toename van de katalytische snelheid kan alleen worden bereikt door de tijd voor diffusie te verkorten. Vergeet niet dat de actieve plaats slechts een klein deel is van de totale enzymstructuur. Toch is bij katalytisch perfecte enzymen elke ontmoeting tussen enzym en substraat productief. In deze gevallen kunnen er aantrekkelijke elektrostatische krachten op het enzym zijn die het substraat naar de actieve plaats lokken. Deze krachten worden soms poëtisch Circe-effecten genoemd.

Circe-effect-

Het gebruik van aantrekkelijke krachten om een substraat naar een plaats te lokken waar het een structuurverandering ondergaat, zoals gedefinieerd door William P. Jencks, een enzymoloog, die de term bedacht.

Een godin uit de Griekse mythologie, Circe, lokte de mannen van Odysseus naar haar huis en veranderde hen vervolgens in varkens.

Tabel 8.8

Enzymen waarvoor kcat/KM dicht bij de diffusiegecontroleerde snelheid van ontmoeting ligt.

De limiet die wordt opgelegd door de diffusiesnelheid in oplossing kan ook gedeeltelijk worden overwonnen door substraten en produkten op te sluiten in het beperkte volume van een multi-enzymcomplex. Sommige reeksen enzymen worden namelijk geassocieerd tot georganiseerde assemblages (paragraaf 17.1.9), zodat het product van het ene enzym zeer snel wordt gevonden door het volgende enzym. In feite worden producten van het ene enzym naar het volgende gekanaliseerd, ongeveer zoals in een lopende band.

8.4.3. De meeste biochemische reacties omvatten meerdere substraten

De meeste reacties in biologische systemen omvatten gewoonlijk twee substraten en twee producten en kunnen worden weergegeven door de bisubstraatreactie:

Bij de meeste van dergelijke reacties wordt een functionele groep, zoals een fosforyl- of een ammoniumgroep, van het ene substraat naar het andere overgebracht. Bij oxidatiereductiereacties worden elektronen overgedragen tussen substraten. Meervoudige substraatreacties kunnen in twee klassen worden verdeeld: sequentiële verplaatsing en dubbele verplaatsing.

Sequentiële verplaatsing

In het sequentiële mechanisme moeten alle substraten zich aan het enzym binden voordat er een product vrijkomt. Bijgevolg vormt zich bij een bisubstraatreactie een ternair complex van het enzym en beide substraten. Er zijn twee soorten sequentiële mechanismen: geordend, waarbij de substraten in een bepaalde volgorde aan het enzym binden, en willekeurig.

Veel enzymen die NAD+ of NADH als substraat hebben, vertonen het sequentiële geordende mechanisme. Denk aan lactaatdehydrogenase, een belangrijk enzym in het glucosemetabolisme (Paragraaf 16.1.9). Dit enzym reduceert pyruvaat tot lactaat terwijl het NADH oxideert tot NAD+.

In het geordende sequentiële mechanisme bindt het co-enzym altijd eerst en wordt het lactaat altijd eerst vrijgemaakt. Deze volgorde kan als volgt worden weergegeven in een notatie die is ontwikkeld door W. Wallace Cleland:

Het enzym bestaat als een ternair complex: eerst het enzym en de substraten en na de katalyse het enzym en de producten.

In het willekeurige sequentiële mechanisme is de volgorde van toevoeging van substraten en vrijkomen van producten willekeurig. Sequentiële toevalsreacties worden geïllustreerd door de vorming van fosfocreatine en ADP uit ATP en creatine, een reactie die wordt gekatalyseerd door creatinekinase (Paragraaf 14.1.5).

Fosfocreatine is een belangrijke energiebron in spieren. Opeenvolgende willekeurige reacties kunnen ook worden afgebeeld in de Cleland-notatie.

Hoewel de volgorde van bepaalde gebeurtenissen willekeurig is, doorloopt de reactie toch de ternaire complexen met eerst de substraten en daarna de producten.

Double-Displacement (Ping-Pong) Reactions

Bij double-displacement, of Ping-Pong, reacties komen een of meer producten vrij voordat alle substraten het enzym hebben gebonden. Het bepalende kenmerk van dubbele-verplaatsingsreacties is het bestaan van een gesubstitueerd enzymtussenproduct, waarin het enzym tijdelijk is gewijzigd. Reacties waarbij aminogroepen worden verplaatst tussen aminozuren en α-ketozuren zijn klassieke voorbeelden van dubbele-verplaatsingsmechanismen. Het enzym aspartaataminotransferase (paragraaf 23.3.1) katalyseert de overdracht van een aminogroep van aspartaat naar α-ketoglutaraat.

De opeenvolging van gebeurtenissen kan in het volgende schema worden weergegeven.

Nadat aspartaat zich aan het enzym bindt, verwijdert het enzym de aminogroep van aspartaat om het gesubstitueerde enzymtussenproduct te vormen. Het eerste product, oxaloacetaat, vertrekt vervolgens. Het tweede substraat, α-ketoglutaraat, bindt aan het enzym, accepteert de aminogroep van het gemodificeerde enzym, en wordt vervolgens vrijgegeven als het eindproduct, glutamaat. In de Cleland-notatie lijken de substraten op en van het enzym te stuiteren naar analogie van een pingpongbal die op een tafel stuitert.

8.4.4. Allosterische Enzymen gehoorzamen niet aan Michaelis-Menten Kinetiek

Het Michaelis-Menten model heeft de ontwikkeling van de enzymchemie zeer bevorderd. Zijn deugden zijn eenvoud en brede toepasbaarheid. Het Michaelis-Menten model kan echter geen rekening houden met de kinetische eigenschappen van veel enzymen. Een belangrijke groep enzymen die niet aan de Michaelis-Menten-kinetiek gehoorzamen zijn de allosterische enzymen. Deze enzymen bestaan uit meerdere subeenheden en meerdere actieve sites.

Allosterische enzymen vertonen vaak sigmoïdale plots (figuur 8.14) van de reactiesnelheid V0 versus substraatconcentratie, in plaats van de hyperbolische plots die worden voorspeld door de Michaelis-Menten-vergelijking (vergelijking 23). In allosterische enzymen kan de binding van substraat aan een actieve plaats de eigenschappen van andere actieve plaatsen in hetzelfde enzymmolecuul beïnvloeden. Een mogelijk resultaat van deze interactie tussen subeenheden is dat de binding van substraat coöperatief wordt; dat wil zeggen, de binding van substraat aan één actieve plaats van het enzym vergemakkelijkt de binding van substraat aan de andere actieve plaatsen. Zoals in hoofdstuk 10 zal worden besproken, resulteert een dergelijke coöperativiteit in een sigmoïdale plot van V0 versus . Bovendien kan de activiteit van een allosterisch enzym worden veranderd door regulerende moleculen die reversibel gebonden zijn aan specifieke plaatsen anders dan de katalytische plaatsen. De katalytische eigenschappen van allosterische enzymen kunnen dus worden aangepast om aan de onmiddellijke behoeften van een cel te voldoen (hoofdstuk 10). Om deze reden zijn allosterische enzymen belangrijke regulatoren van metabolische routes in de cel.

Figuur 8.14

Kinetiek voor een allosterisch enzym. Allosterische enzymen vertonen een sigmoïdale afhankelijkheid van de reactiesnelheid van de substraatconcentratie.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.