Bookshelf

by admin Leave Comment

Enzymernas primära funktion är att öka reaktionshastigheten så att den är förenlig med organismens behov. För att förstå hur enzymer fungerar behöver vi en kinetisk beskrivning av deras aktivitet. För många enzymer varierar katalyshastigheten V0, som definieras som antalet mol produkt som bildas per sekund, med substratkoncentrationen på det sätt som visas i figur 8.11. Katalyshastigheten ökar linjärt när substratkoncentrationen ökar och börjar sedan plana ut och närma sig ett maximum vid högre substratkoncentrationer. Innan vi kan tolka denna graf korrekt måste vi förstå hur den genereras. Betrakta ett enzym som katalyserar S till P genom följande väg:

Omfattningen av produktbildningen bestäms som en funktion av tiden för en serie substratkoncentrationer (figur 8.12). Som förväntat ökar mängden bildad produkt i varje fall med tiden, även om man så småningom når en tidpunkt då det inte sker någon nettoförändring i koncentrationen av S eller P. Enzymet omvandlar fortfarande aktivt substrat till produkt och vice versa, men reaktionsjämvikt har uppnåtts. Figur 8.13A illustrerar de koncentrationsförändringar som observeras i alla reaktionsdeltagare med tiden tills jämvikt har uppnåtts.

Figur 8.12

Bestämning av den initiala hastigheten. Mängden produkt som bildas vid olika substratkoncentrationer plottas som en funktion av tiden. Den initiala hastigheten (V0) för varje substratkoncentration bestäms från kurvans lutning i början av (mer…)

Figur 8.13

Förändringar i koncentrationen av reaktionsdeltagarna i en enzymkatalyserad reaktion med tiden. Koncentrationsförändringar under (A) steady-state-förhållanden och (B) förhållanden före steady-state-förhållanden.

Enzymkinetik är lättare att närma sig om man kan bortse från bakre reaktionen. Vi definierar V0 som hastigheten för ökningen av produkten med tiden när är låg; det vill säga vid tider nära noll (därav V0) (figur 8.13B). För grafen i figur 8.11 bestäms alltså V0 för varje substratkoncentration genom att mäta hastigheten för produktbildning vid tidiga tidpunkter innan P ackumuleras (se figur 8.12).

Vi börjar vår kinetiska undersökning av enzymaktivitet med grafen som visas i figur 8.11. Vid en fast koncentration av enzymet är V0 nästan linjärt proportionell mot när är liten men är nästan oberoende av när är stor. År 1913 föreslog Leonor Michaelis och Maud Menten en enkel modell för att förklara dessa kinetiska egenskaper. Det kritiska inslaget i deras behandling är att ett specifikt ES-komplex är en nödvändig intermediär i katalysen. Den föreslagna modellen, som är den enklaste som redogör för de kinetiska egenskaperna hos många enzymer, är

Ett enzym E kombineras med substrat S för att bilda ett ES-komplex, med en hastighetskonstant k1. ES-komplexet har två möjliga öden. Det kan dissociera till E och S, med en hastighetskonstant k-1, eller så kan det fortsätta att bilda produkten P, med en hastighetskonstant k2. Återigen antar vi att nästan ingen av produkten återgår till det ursprungliga substratet, ett villkor som gäller i det inledande skedet av en reaktion innan koncentrationen av produkten är märkbar.

Vi vill ha ett uttryck som relaterar katalyshastigheten till substrat- och enzymkoncentrationerna och hastigheterna för de enskilda stegen. Vår utgångspunkt är att den katalytiska hastigheten är lika med produkten av koncentrationen av ES-komplexet och k2.

Nu måste vi uttrycka i termer av kända kvantiteter. Hastigheten för bildning och nedbrytning av ES ges av:

För att förenkla kommer vi att arbeta med antagandet om steady-state. I ett steady state förblir koncentrationerna av intermediärer, i det här fallet , oförändrade även om koncentrationerna av utgångsmaterial och produkter förändras. Detta inträffar när bildnings- och nedbrytningshastigheterna för ES-komplexet är lika stora. Om man sätter de högra sidorna i ekvationerna 11 och 12 lika ger

Omställer man ekvation 13 får man

Ekvation 14 kan förenklas genom att man definierar en ny konstant, KM, som kallas för Michaeliskonstanten:

Observera att KM har enheterna för koncentration. KM är en viktig egenskap för interaktioner mellan enzym och substrat och är oberoende av enzym- och substratkoncentrationer.

Insätt ekvation 15 i ekvation 14 och lös för ger

Nu ska vi undersöka täljaren i ekvation 16. Koncentrationen av okombinerat substrat är mycket nära nog lika med den totala substratkoncentrationen, förutsatt att koncentrationen av enzym är mycket lägre än substratkoncentrationen. Koncentrationen av okombinerat enzym är lika med den totala enzymkoncentrationen T minus koncentrationen av ES-komplexet.

Substituerar man detta uttryck för i ekvation 16 får man

Lösning av ekvation 18 för ger

eller

Där man substituerar detta uttryck för i ekvation 10, får vi

Den maximala hastigheten, Vmax, uppnås när de katalytiska platserna på enzymet är mättade med substrat – det vill säga när = T. Således,

Substituerar man ekvation 22 i ekvation 21 får man Michaelis-Mentens ekvation:

Denna ekvation förklarar de kinetiska data som ges i figur 8.11. Vid mycket låg substratkoncentration, när är mycket mindre än KM, är V0 = (Vmax/KM), dvs. hastigheten är direkt proportionell mot substratkoncentrationen. Vid hög substratkoncentration, när är mycket större än KM, är V0 = Vmax, dvs. hastigheten är maximal, oberoende av substratkoncentrationen.

Betydelsen av KM framgår av ekvation 23. När = KM, då är V0 = Vmax/2. KM är således lika med den substratkoncentration vid vilken reaktionshastigheten är hälften av sitt maximala värde. KM är en viktig egenskap hos en enzymkatalyserad reaktion och har betydelse för dess biologiska funktion.

Den fysiologiska konsekvensen av KM illustreras av vissa individers känslighet för etanol. Sådana personer uppvisar ansiktsrodnad och snabb hjärtfrekvens (takykardi) efter att ha fått i sig även små mängder alkohol. I levern omvandlar alkoholdehydrogenas etanol till acetaldehyd.

Normalt omvandlas acetaldehyd, som är orsaken till symtomen när det förekommer i höga koncentrationer, till acetat av acetaldehyddehydrogenas.

De flesta människor har två former av acetaldehyddehydrogenas, en mitokondriell form med låg KM och en cytosolisk form med hög KM. Hos mottagliga personer är det mitokondriella enzymet mindre aktivt på grund av utbytet av en enda aminosyra, och acetaldehyd bearbetas endast av det cytosoliska enzymet. Eftersom detta enzym har en hög KM omvandlas mindre acetaldehyd till acetat; överskott av acetaldehyd läcker ut i blodet och står för de fysiologiska effekterna.

8.4.1. Betydelsen av KM- och Vmax-värden

Konceptuella insikter, enzymkinetik i stationärt tillstånd

Lär dig hur de kinetiska parametrarna KMoch Vmaxkan bestämmas experimentellt med hjälp av den enzymkinetiska labbsimuleringen i denna mediemodul.

Michaeliskonstanten, KM, och den maximala hastigheten, Vmax, kan lätt härledas från katalyshastigheter som uppmätts vid olika substratkoncentrationer om ett enzym fungerar enligt det enkla schema som ges i ekvation 23. Avledning av KM och Vmax sker oftast med hjälp av kurvanpassningsprogram på en dator (se bilagan till detta kapitel för alternativa metoder för att bestämma KM och Vmax). Enzymernas KM-värden varierar kraftigt (tabell 8.5). För de flesta enzymer ligger KM mellan 10-1 och 10-7 M. KM-värdet för ett enzym beror på det specifika substratet och på miljöförhållanden som pH, temperatur och jonstyrka. Michaeliskonstanten, KM, har två betydelser. För det första är KM den koncentration av substrat vid vilken hälften av de aktiva platserna är fyllda. KM ger således ett mått på den substratkoncentration som krävs för att en betydande katalys ska ske. För många enzymer tyder experimentella bevis på att KM ger en approximation av substratkoncentrationen in vivo. När KM är känt kan andelen fyllda platser, fES, vid varje substratkoncentration beräknas från

Tabell 8.5

KM-värden för vissa enzymer.

För det andra är KM relaterat till hastighetskonstanter för de enskilda stegen i det katalytiska schemat enligt ekvation 9. I ekvation 15 definieras KM som (k-1 + k2)/k1. Tänk på ett gränsfall där k-1 är mycket större än k2. Under sådana omständigheter dissocieras ES-komplexet till E och S mycket snabbare än vad produkten bildas. Under dessa förhållanden (k-1 >> k2),

Dissociationskonstanten för ES-komplexet ges av

Med andra ord är KM lika med dissociationskonstanten för ES-komplexet om k2 är mycket mindre än k-1. När detta villkor är uppfyllt är KM ett mått på ES-komplexets styrka: ett högt KM indikerar svag bindning, ett lågt KM indikerar stark bindning. Det måste betonas att KM anger ES-komplexets affinitet endast när k-1 är mycket större än k2.

Den maximala hastigheten, Vmax, avslöjar omsättningssiffran för ett enzym, vilket är antalet substratmolekyler som omvandlas till produkt av en enzymmolekyl under en tidsenhet när enzymet är helt mättat med substrat. Det är lika med den kinetiska konstanten k2, som också kallas kcat. Den maximala hastigheten, Vmax, avslöjar omsättningsantalet för ett enzym om koncentrationen av aktiva platser T är känd, eftersom

och därmed

En 10-6 M-lösning av kolsyreanhydras katalyserar t.ex. bildandet av 0,6 M H2CO3 per sekund när den är helt mättad med substrat. Därför är k2 6 × 105 s-1. Detta omsättningstal är ett av de största kända. Varje katalyserad reaktion äger rum på en tid som är lika med 1/k2, vilket är 1,7 μs för kolsyreanhydras. Omsättningstalen för de flesta enzymer med sina fysiologiska substrat ligger i intervallet 1 till 104 per sekund (tabell 8.6).

Tabell 8.6

Maximala omsättningstal för vissa enzymer.

8.4.2. Kinetisk perfektion i enzymatisk katalys: Kriteriet kcat/KM

När substratkoncentrationen är mycket större än KM är katalyshastigheten lika med kcat, omsättningstalet, enligt beskrivningen i avsnitt 8.4.1. De flesta enzymer är dock normalt inte mättade med substrat. Under fysiologiska förhållanden är förhållandet /KM vanligtvis mellan 0,01 och 1,0. När << KM är enzymhastigheten mycket lägre än kcat eftersom de flesta av de aktiva platserna inte är upptagna. Finns det ett tal som karakteriserar kinetiken för ett enzym under dessa mer typiska cellförhållanden? Ja, det finns det, vilket kan visas genom att kombinera ekvationerna 10 och 16 för att få

När << KM är koncentrationen av fritt enzym, , nästan lika med den totala koncentrationen av enzym, så

Därmed, när << KM, beror den enzymatiska hastigheten på värdena för kcat/KM, , och T. Under dessa förhållanden är kcat/KM hastighetskonstanten för interaktionen mellan S och E och kan användas som ett mått på katalytisk effektivitet. Genom att använda kcat/KM-värden kan man till exempel jämföra ett enzyms preferens för olika substrat. Tabell 8.7 visar kcat/KM-värdena för flera olika substrat för chymotrypsin (avsnitt 9.1.1). Chymotrypsin har tydligt en preferens för att klyva intill skrymmande, hydrofoba sidokedjor.

Tabell 8.7

Substratpreferenser för chymotrypsin.

Hur effektivt kan ett enzym vara? Vi kan närma oss denna fråga genom att bestämma om det finns några fysiska gränser för värdet av kcat/KM. Observera att detta förhållande beror på k1, k-1 och kcat, vilket kan visas genom att ersätta KM.

Antag att bildningshastigheten för produkten (kcat) är mycket snabbare än dissocieringshastigheten för ES-komplexet (k-1). Värdet för kcat/KM närmar sig då k1. Den yttersta gränsen för värdet av kcat/KM sätts således av k1, bildningshastigheten för ES-komplexet. Denna hastighet kan inte vara snabbare än det diffusionskontrollerade mötet mellan ett enzym och dess substrat. Diffusionen begränsar värdet av k1 så att det inte kan vara högre än mellan 108 och 109 s-1 M-1. Därför är den övre gränsen för kcat/KM mellan 108 och 109 s-1 M-1.

Kcat/KM-förhållandena för enzymerna superoxiddismutas, acetylkolinesteras och triosfosfatisomeras ligger mellan 108 och 109 s-1 M-1. Enzymer som dessa som har kcat/KM-förhållanden vid de övre gränserna har uppnått kinetisk perfektion. Deras katalytiska hastighet begränsas endast av den hastighet med vilken de möter substrat i lösningen (tabell 8.8). En ytterligare ökning av den katalytiska hastigheten kan endast uppnås genom att minska tiden för diffusion. Kom ihåg att den aktiva platsen bara är en liten del av den totala enzymstrukturen. För katalytiskt perfekta enzymer är dock varje möte mellan enzym och substrat produktivt. I dessa fall kan det finnas attraktiva elektrostatiska krafter på enzymet som lockar substratet till den aktiva platsen. Dessa krafter kallas ibland poetiskt för Circe-effekter.

Circe-effekt-

Utnyttjandet av attraktiva krafter för att locka ett substrat till en plats där det genomgår en strukturomvandling, enligt definitionen av William P. Jencks, en enzymolog, som myntade termen.

En gudinna i den grekiska mytologin Circe lockade Odysseus män till sitt hus och förvandlade dem sedan till grisar.

Tabell 8.8

Enzymer för vilka kcat/KM ligger nära den diffusionskontrollerade möteshastigheten.

Begränsningen av spridningshastigheten i lösning kan också delvis övervinnas genom att substrat och produkter begränsas i den begränsade volymen av ett multienzymkomplex. Vissa serier av enzymer är nämligen associerade i organiserade sammansättningar (avsnitt 17.1.9) så att produkten från ett enzym mycket snabbt hittas av nästa enzym. I själva verket kanaliseras produkterna från ett enzym till nästa, ungefär som i ett löpande band.

8.4.3. De flesta biokemiska reaktioner omfattar flera substrat

De flesta reaktioner i biologiska system omfattar vanligtvis två substrat och två produkter och kan representeras av bisubstratreaktionen:

Majoriteten av sådana reaktioner innebär att en funktionell grupp, t.ex. en fosforyl- eller en ammoniumgrupp, överförs från ett substrat till ett annat. Vid oxidations-reduktionsreaktioner överförs elektroner mellan substrat. Reaktioner med flera substrat kan delas in i två klasser: sekventiell förskjutning och dubbel förskjutning.

Sequentiell förskjutning

I den sekventiella mekanismen måste alla substrat binda till enzymet innan någon produkt frigörs. Följaktligen bildas i en bisubstratreaktion ett ternärt komplex av enzymet och båda substraten. Sekventiella mekanismer är av två typer: ordnade, där substraten binder enzymet i en definierad sekvens, och slumpmässiga.

Många enzymer som har NAD+ eller NADH som substrat uppvisar den sekventiella ordnade mekanismen. Tänk på laktatdehydrogenas, ett viktigt enzym i glukosmetabolismen (avsnitt 16.1.9). Detta enzym reducerar pyruvat till laktat samtidigt som det oxiderar NADH till NAD+.

I den ordnade sekventiella mekanismen binder koenzymet alltid först och laktat frigörs alltid först. Denna sekvens kan representeras på följande sätt i en notation som utvecklats av W. Wallace Cleland:

Enzymet existerar som ett ternärt komplex: först består det av enzymet och substrat och efter katalysen av enzymet och produkter.

I den slumpmässiga sekventiella mekanismen är ordningsföljden för tillsättning av substrat och frisättning av produkter slumpmässig. Sekventiella slumpmässiga reaktioner illustreras av bildandet av fosfokreatin och ADP från ATP och kreatin, en reaktion som katalyseras av kreatinkinas (avsnitt 14.1.5).

Fosfokreatin är en viktig energikälla i muskler. Sekventiella slumpmässiga reaktioner kan också avbildas med Cleland-notationen.

Trots att ordningsföljden för vissa händelser är slumpmässig, passerar reaktionen ändå genom de ternära komplexen som inkluderar först substrat och sedan produkter.

Double-Displacement (Ping-Pong) Reactions

I double-displacement, eller Ping-Pong, reaktioner frigörs en eller flera produkter innan alla substrat binder enzymet. Det utmärkande kännetecknet för dubbelplaceringsreaktioner är förekomsten av en substituerad enzymintermediär, där enzymet är tillfälligt modifierat. Reaktioner som skickar aminogrupper mellan aminosyror och α-ketosyror är klassiska exempel på mekanismer för dubbelförskjutning. Enzymet aspartataminotransferas (avsnitt 23.3.1) katalyserar överföringen av en aminogrupp från aspartat till α-ketoglutarat.

Händelseförloppet kan avbildas i följande diagram.

När aspartat binder till enzymet tar enzymet bort aspartats aminogrupp och bildar den substituerade enzymintermediären. Den första produkten, oxaloacetat, avgår därefter. Det andra substratet, α-ketoglutarat, binder till enzymet, tar emot aminogruppen från det modifierade enzymet och frigörs sedan som slutprodukt, glutamat. I Cleland-notationen verkar substraten hoppa på och av enzymet analogt med en pingisboll som hoppar på ett bord.

8.4.4. Allosteriska enzymer lyder inte Michaelis-Mentens kinetik

Michaelis-Menten-modellen har i hög grad bidragit till utvecklingen av enzymkemin. Dess förtjänster är enkelhet och bred tillämpbarhet. Michaelis-Menten-modellen kan dock inte redogöra för de kinetiska egenskaperna hos många enzymer. En viktig grupp enzymer som inte följer Michaelis-Mentens kinetik är de allosteriska enzymerna. Dessa enzymer består av flera underenheter och flera aktiva platser.

Allosteriska enzymer uppvisar ofta sigmoidala kurvor (figur 8.14) av reaktionshastigheten V0 i förhållande till substratkoncentrationen , i stället för de hyperboliska kurvor som förutsägs av Michaelis-Mentens ekvation (ekvation 23). I allosteriska enzymer kan bindningen av substrat till en aktiv plats påverka egenskaperna hos andra aktiva platser i samma enzymmolekyl. Ett möjligt resultat av denna interaktion mellan subenheterna är att bindningen av substratet blir kooperativ, dvs. att bindningen av substratet till en aktiv plats i enzymet underlättar substratbindningen till de andra aktiva platserna. Som vi kommer att se i kapitel 10 resulterar en sådan kooperativitet i en sigmoidal kurva av V0 mot . Dessutom kan aktiviteten hos ett allosteriskt enzym ändras av reglerande molekyler som är reversibelt bundna till andra specifika platser än de katalytiska platserna. De katalytiska egenskaperna hos allosteriska enzymer kan således justeras för att tillgodose en cells omedelbara behov (kapitel 10). Av denna anledning är allosteriska enzymer viktiga regulatorer av metaboliska vägar i cellen.

Figur 8.14

Kinetik för ett allosteriskt enzym. Allosteriska enzymer uppvisar ett sigmoidalt beroende av reaktionshastigheten på substratkoncentrationen.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.