La fonction première des enzymes est d’augmenter les vitesses des réactions afin qu’elles soient compatibles avec les besoins de l’organisme. Pour comprendre le fonctionnement des enzymes, nous avons besoin d’une description cinétique de leur activité. Pour de nombreuses enzymes, la vitesse de catalyse V0, qui est définie comme le nombre de moles de produit formé par seconde, varie en fonction de la concentration du substrat, comme le montre la figure 8.11. La vitesse de catalyse augmente de façon linéaire lorsque la concentration de substrat augmente, puis commence à se stabiliser et à approcher un maximum à des concentrations de substrat plus élevées. Avant de pouvoir interpréter ce graphique avec précision, nous devons comprendre comment il est généré. Considérons une enzyme qui catalyse le S en P par la voie suivante :
- Figure 8.11
- Figure 8.12
- Figure 8.13
- 8.4.1. La signification des valeurs KM et Vmax
- Intérêt conceptuel, cinétique enzymatique en régime permanent
- Tableau 8.5
- Tableau 8.6
- 8.4.2. Perfectionnement cinétique en catalyse enzymatique : Le critère kcat/KM
- Tableau 8.7
- Effet Circe-
- Tableau 8.8
- 8.4.3. La plupart des réactions biochimiques comprennent plusieurs substrats
- Déplacement séquentiel
- Réactions à double déplacement (Ping-Pong)
- 8.4.4. Les enzymes allostériques n’obéissent pas à la cinétique de Michaelis-Menten
- Figure 8.14
Figure 8.11
Cinétique de Michaëlis-Menten. Un tracé de la vitesse de réaction (V0) en fonction de la concentration en substrat pour une enzyme qui obéit à la cinétique de Michaelis-Menten montre que la vitesse maximale (Vmax) est approchée de manière asymptotique. La constante de Michaelis (suite…)
L’étendue de la formation du produit est déterminée en fonction du temps pour une série de concentrations de substrat (Figure 8.12). Comme prévu, dans chaque cas, la quantité de produit formé augmente avec le temps, bien que l’on arrive à un moment où il n’y a pas de changement net dans la concentration de S ou de P. L’enzyme continue à convertir activement le substrat en produit et vice versa, mais l’équilibre de la réaction a été atteint. La figure 8.13A illustre les changements de concentration observés dans tous les participants à la réaction en fonction du temps jusqu’à ce que l’équilibre soit atteint.
Figure 8.12
Détermination de la vitesse initiale. La quantité de produit formé à différentes concentrations de substrat est tracée en fonction du temps. La vitesse initiale (V0) pour chaque concentration de substrat est déterminée à partir de la pente de la courbe au début de (suite…)
Figure 8.13
Changements de la concentration des participants à la réaction d’une réaction catalysée par une enzyme avec le temps. Changements de concentration dans (A) les conditions d’état d’équilibre, et (B) les conditions de pré-état d’équilibre.
La cinétique enzymatique est plus facilement abordée si nous pouvons ignorer la réaction en retour. Nous définissons V0 comme le taux d’augmentation du produit avec le temps lorsque est faible, c’est-à-dire à des moments proches de zéro (d’où V0) (figure 8.13B). Ainsi, pour le graphique de la figure 8.11, V0 est déterminé pour chaque concentration de substrat en mesurant la vitesse de formation du produit aux premiers temps avant que P ne s’accumule (voir figure 8.12).
Nous commençons notre examen cinétique de l’activité enzymatique avec le graphique de la figure 8.11. A une concentration fixe d’enzyme, V0 est presque linéairement proportionnel à quand est petit mais est presque indépendant de quand est grand. En 1913, Leonor Michaelis et Maud Menten ont proposé un modèle simple pour rendre compte de ces caractéristiques cinétiques. La caractéristique critique de leur traitement est qu’un complexe ES spécifique est un intermédiaire nécessaire dans la catalyse. Le modèle proposé, qui est le plus simple et qui rend compte des propriétés cinétiques de nombreuses enzymes, est
Une enzyme E se combine avec le substrat S pour former un complexe ES, avec une constante de vitesse k1. Le complexe ES a deux destins possibles. Il peut se dissocier en E et S, avec une constante de vitesse k-1, ou il peut procéder à la formation du produit P, avec une constante de vitesse k2. Encore une fois, nous supposons que presque aucun produit ne retourne au substrat initial, une condition qui se vérifie au stade initial d’une réaction avant que la concentration de produit soit appréciable.
Nous voulons une expression qui relie la vitesse de la catalyse aux concentrations du substrat et de l’enzyme et aux vitesses des étapes individuelles. Notre point de départ est que la vitesse de catalyse est égale au produit de la concentration du complexe ES et de k2.
Nous devons maintenant exprimer en termes de quantités connues. Les taux de formation et de dégradation des ES sont donnés par :
Pour simplifier les choses, nous travaillerons dans l’hypothèse d’un état d’équilibre. Dans un état d’équilibre, les concentrations des intermédiaires, dans ce cas , restent les mêmes même si les concentrations des matières premières et des produits changent. Cela se produit lorsque les taux de formation et de dégradation du complexe ES sont égaux. En mettant les côtés droits des équations 11 et 12 égaux, on obtient
En réarrangeant l’équation 13, on obtient
L’équation 14 peut être simplifiée en définissant une nouvelle constante, KM, appelée constante de Michaelis :
Notez que KM a les unités de concentration. KM est une caractéristique importante des interactions enzyme-substrat et est indépendante des concentrations en enzyme et en substrat.
Insérer l’équation 15 dans l’équation 14 et résoudre pour donne
Examinons maintenant le numérateur de l’équation 16. La concentration du substrat non combiné est très proche de la concentration totale du substrat, à condition que la concentration de l’enzyme soit beaucoup plus faible que celle du substrat. La concentration d’enzyme non combinée est égale à la concentration totale d’enzyme T moins la concentration du complexe ES.
Substituer cette expression pour dans l’équation 16 donne
Solver l’équation 18 pour donne
ou
En substituant cette expression pour dans l’équation 10, on obtient
La vitesse maximale, Vmax, est atteinte lorsque les sites catalytiques de l’enzyme sont saturés de substrat, c’est-à-dire lorsque = T. Ainsi,
Substituer l’équation 22 à l’équation 21 donne l’équation de Michaelis-Menten :
Cette équation explique les données cinétiques données dans la figure 8.11. À très faible concentration de substrat, lorsque est beaucoup moins que KM, V0 = (Vmax/KM) ; c’est-à-dire que la vitesse est directement proportionnelle à la concentration de substrat. À une concentration élevée de substrat, lorsque est beaucoup plus grand que KM, V0 = Vmax ; c’est-à-dire que le taux est maximal, indépendant de la concentration de substrat.
La signification de KM est évidente à partir de l’équation 23. Lorsque = KM, alors V0 = Vmax/2. Ainsi, KMest égal à la concentration de substrat à laquelle la vitesse de réaction est la moitié de sa valeur maximale. Le KM est une caractéristique importante d’une réaction catalysée par une enzyme et est significatif pour sa fonction biologique.
La conséquence physiologique du KM est illustrée par la sensibilité de certains individus à l’éthanol. Ces personnes présentent des bouffées vasomotrices et un rythme cardiaque rapide (tachycardie) après avoir ingéré des quantités d’alcool, même faibles. Dans le foie, l’alcool déshydrogénase transforme l’éthanol en acétaldéhyde.
Normalement, l’acétaldéhyde, qui est la cause des symptômes lorsqu’il est présent à des concentrations élevées, est transformé en acétate par l’acétaldéhyde déshydrogénase.
La plupart des gens ont deux formes de l’acétaldéhyde déshydrogénase, une forme mitochondriale à faible KM et une forme cytosolique à KM élevé. Chez les personnes sensibles, l’enzyme mitochondriale est moins active en raison de la substitution d’un seul acide aminé, et l’acétaldéhyde est traité uniquement par l’enzyme cytosolique. Comme cette enzyme a un KM élevé, moins d’acétaldéhyde est transformé en acétate ; l’excès d’acétaldéhyde s’échappe dans le sang et explique les effets physiologiques.
8.4.1. La signification des valeurs KM et Vmax
Intérêt conceptuel, cinétique enzymatique en régime permanent
Apprenez comment les paramètres cinétiques KMet Vmax peuvent être déterminés expérimentalement en utilisant la simulation de laboratoire de cinétique enzymatique dans ce module média.
La constante de Michaelis, KM, et la vitesse maximale, Vmax, peuvent être facilement dérivées des taux de catalyse mesurés à une variété de concentrations de substrat si une enzyme fonctionne selon le schéma simple donné par l’équation 23. La dérivation de KM et Vmax est le plus souvent réalisée à l’aide de programmes d’ajustement de courbe sur ordinateur (voir l’annexe de ce chapitre pour d’autres moyens de déterminer KM et Vmax). Les valeurs de KM des enzymes sont très variables (tableau 8.5). Pour la plupart des enzymes, la valeur KM se situe entre 10-1 et 10-7 M. La valeur KM d’une enzyme dépend du substrat particulier et des conditions environnementales telles que le pH, la température et la force ionique. La constante de Michaelis, KM, a deux significations. Premièrement, KM est la concentration de substrat à laquelle la moitié des sites actifs sont remplis. Ainsi, KM fournit une mesure de la concentration de substrat nécessaire pour qu’une catalyse significative ait lieu. En fait, pour de nombreuses enzymes, les preuves expérimentales suggèrent que la KM fournit une approximation de la concentration de substrat in vivo. Lorsque la KM est connue, la fraction de sites remplis, fES, à n’importe quelle concentration de substrat peut être calculée à partir
Tableau 8.5
Valeurs de la KM de certaines enzymes.
Deuxièmement, le KM est lié aux constantes de vitesse des étapes individuelles du schéma catalytique donné dans l’équation 9. Dans l’équation 15, KM est défini comme (k-1 + k2)/k1. Considérons un cas limite dans lequel k-1 est beaucoup plus grand que k2. Dans de telles circonstances, le complexe ES se dissocie en E et S beaucoup plus rapidement que le produit n’est formé. Dans ces conditions (k-1 >> k2),
La constante de dissociation du complexe ES est donnée par
En d’autres termes, KMest égale à la constante de dissociation du complexe ES si k2 est beaucoup plus petit que k-1. Lorsque cette condition est remplie, KM est une mesure de la force du complexe ES : un KM élevé indique une liaison faible ; un KM faible indique une liaison forte. Il faut souligner que le KM n’indique l’affinité du complexe ES que lorsque k-1 est beaucoup plus grand que k2.
La vitesse maximale, Vmax, révèle le nombre de rotation d’une enzyme, qui est le nombre de molécules de substrat converties en produit par une molécule d’enzyme en une unité de temps lorsque l’enzyme est totalement saturée en substrat. Il est égal à la constante cinétique k2, également appelée kcat. La vitesse maximale, Vmax, révèle le nombre de rotation d’une enzyme si la concentration des sites actifs T est connue, car
et donc
Par exemple, une solution 10-6 M d’anhydrase carbonique catalyse la formation de 0,6 M H2CO3 par seconde lorsqu’elle est totalement saturée en substrat. Par conséquent, k2 est de 6 × 105 s-1. Ce nombre de rotation est l’un des plus grands connus. Chaque réaction catalysée a lieu en un temps égal à 1/k2, soit 1,7 μs pour l’anhydrase carbonique. Les nombres de renouvellement de la plupart des enzymes avec leurs substrats physiologiques se situent dans une fourchette de 1 à 104 par seconde (tableau 8.6).
Tableau 8.6
Nombre maximal de renouvellement de certaines enzymes.
8.4.2. Perfectionnement cinétique en catalyse enzymatique : Le critère kcat/KM
Lorsque la concentration du substrat est beaucoup plus grande que KM, la vitesse de catalyse est égale à kcat, le nombre de rotation, comme décrit dans la section 8.4.1. Cependant, la plupart des enzymes ne sont normalement pas saturées en substrat. Dans des conditions physiologiques, le rapport /KM est généralement compris entre 0,01 et 1,0. Lorsque << KM, la vitesse enzymatique est bien inférieure à kcat car la plupart des sites actifs sont inoccupés. Existe-t-il un nombre qui caractérise la cinétique d’une enzyme dans ces conditions cellulaires plus typiques ? En effet, il y en a un, comme on peut le montrer en combinant les équations 10 et 16 pour donner
Quand << KM, la concentration d’enzyme libre, , est presque égale à la concentration totale d’enzyme , donc
Donc, quand << KM, la vitesse enzymatique dépend des valeurs de kcat/KM, , et T. Dans ces conditions, kcat/KM est la constante de vitesse pour l’interaction de S et E et peut être utilisée comme une mesure de l’efficacité catalytique. Par exemple, en utilisant les valeurs kcat/KM, on peut comparer la préférence d’une enzyme pour différents substrats. Le tableau 8.7 montre les valeurs kcat/KM pour plusieurs substrats différents de la chymotrypsine (section 9.1.1). La chymotrypsine a clairement une préférence pour le clivage à côté des chaînes latérales volumineuses et hydrophobes.
Tableau 8.7
Préférences de substrats de la chymotrypsine.
Quelle peut être l’efficacité d’une enzyme ? Nous pouvons aborder cette question en déterminant s’il existe des limites physiques à la valeur de kcat/KM. Notons que ce rapport dépend de k1, k-1 et kcat, comme on peut le montrer en substituant à KM.
Supposons que la vitesse de formation du produit (kcat) soit beaucoup plus rapide que la vitesse de dissociation du complexe ES (k-1). La valeur de kcat/KM se rapproche alors de k1. Ainsi, la limite ultime de la valeur de kcat/KM est fixée par k1, la vitesse de formation du complexe ES. Cette vitesse ne peut pas être plus rapide que la rencontre contrôlée par diffusion d’une enzyme et de son substrat. La diffusion limite la valeur de k1 de sorte qu’elle ne peut être supérieure à une valeur comprise entre 108 et 109 s-1 M-1. Par conséquent, la limite supérieure de kcat/KM est comprise entre 108 et 109 s-1 M-1.
Les rapports kcat/KM des enzymes superoxyde dismutase, acétylcholinestérase et triose phosphate isomérase sont compris entre 108 et 109 s-1 M-1. Ces enzymes, dont les rapports kcat/KM se situent aux limites supérieures, ont atteint la perfection cinétique. Leur vitesse catalytique n’est limitée que par la vitesse à laquelle elles rencontrent le substrat dans la solution (tableau 8.8). Toute augmentation supplémentaire de la vitesse catalytique ne peut se faire qu’en diminuant le temps de diffusion. N’oubliez pas que le site actif ne représente qu’une petite partie de la structure totale de l’enzyme. Pourtant, pour les enzymes catalytiquement parfaites, chaque rencontre entre l’enzyme et le substrat est productive. Dans ces cas, il peut y avoir des forces électrostatiques attractives sur l’enzyme qui attirent le substrat vers le site actif. Ces forces sont parfois appelées poétiquement effets Circe.
Effet Circe-
L’utilisation de forces attractives pour attirer un substrat dans un site dans lequel il subit une transformation de structure, comme défini par William P. Jencks, un enzymologiste, qui a inventé le terme.
Déesse de la mythologie grecque, Circé attirait les hommes d’Ulysse chez elle puis les transformait en cochons.
Tableau 8.8
Enzymes pour lesquelles kcat/KM est proche de la vitesse de rencontre contrôlée par diffusion.
La limite imposée par la vitesse de diffusion en solution peut aussi être partiellement surmontée en confinant les substrats et les produits dans le volume limité d’un complexe multi-enzyme. En effet, certaines séries d’enzymes sont associées en assemblages organisés (section 17.1.9) de sorte que le produit d’une enzyme est très rapidement trouvé par l’enzyme suivante. En effet, les produits sont canalisés d’une enzyme à la suivante, un peu comme dans une chaîne de montage.
8.4.3. La plupart des réactions biochimiques comprennent plusieurs substrats
La plupart des réactions dans les systèmes biologiques comprennent habituellement deux substrats et deux produits et peuvent être représentées par la réaction bisubstrat :
La majorité de ces réactions impliquent le transfert d’un groupe fonctionnel, tel qu’un groupe phosphoryle ou ammonium, d’un substrat à l’autre. Dans les réactions d’oxydoréduction, les électrons sont transférés entre les substrats. Les réactions à substrats multiples peuvent être divisées en deux classes : le déplacement séquentiel et le double déplacement.
Déplacement séquentiel
Dans le mécanisme séquentiel, tous les substrats doivent se lier à l’enzyme avant qu’un quelconque produit ne soit libéré. Par conséquent, dans une réaction bisubstrat, un complexe ternaire de l’enzyme et des deux substrats se forme. Les mécanismes séquentiels sont de deux types : ordonnés, dans lesquels les substrats se lient à l’enzyme dans une séquence définie, et aléatoires.
De nombreuses enzymes qui ont le NAD+ ou le NADH comme substrat présentent le mécanisme séquentiel ordonné. Considérons la lactate déshydrogénase, une enzyme importante dans le métabolisme du glucose (section 16.1.9). Cette enzyme réduit le pyruvate en lactate tout en oxydant le NADH en NAD+.
Dans le mécanisme séquentiel ordonné, la coenzyme se lie toujours en premier et le lactate est toujours libéré en premier. Cette séquence peut être représentée comme suit dans une notation développée par W. Wallace Cleland:
L’enzyme existe sous forme d’un complexe ternaire : d’abord, constitué de l’enzyme et des substrats et, après catalyse, de l’enzyme et des produits.
Dans le mécanisme séquentiel aléatoire, l’ordre d’addition des substrats et de libération des produits est aléatoire. Les réactions aléatoires séquentielles sont illustrées par la formation de phosphocréatine et d’ADP à partir d’ATP et de créatine, une réaction catalysée par la créatine kinase (section 14.1.5).
La phosphocréatine est une source d’énergie importante dans le muscle. Les réactions aléatoires séquentielles peuvent également être représentées dans la notation de Cleland.
Bien que l’ordre de certains événements soit aléatoire, la réaction passe tout de même par les complexes ternaires comprenant, d’abord, les substrats et, ensuite, les produits.
Réactions à double déplacement (Ping-Pong)
Dans les réactions à double déplacement, ou Ping-Pong, un ou plusieurs produits sont libérés avant que tous les substrats ne se lient à l’enzyme. La caractéristique déterminante des réactions à double déplacement est l’existence d’un intermédiaire enzymatique substitué, dans lequel l’enzyme est temporairement modifiée. Les réactions de navette des groupes amino entre les acides aminés et les α-cétoacides sont des exemples classiques de mécanismes de double déplacement. L’enzyme aspartate aminotransférase (section 23.3.1) catalyse le transfert d’un groupe amino de l’aspartate vers l’α-cétoglutarate.
La séquence des événements peut être représentée par le schéma suivant.
Après que l’aspartate se soit lié à l’enzyme, celle-ci retire le groupe amino de l’aspartate pour former l’intermédiaire enzymatique substitué. Le premier produit, l’oxaloacétate, part ensuite. Le second substrat, l’α-cétoglutarate, se lie à l’enzyme, accepte le groupe amino de l’enzyme modifiée, puis est libéré comme produit final, le glutamate. Dans la notation de Cleland, les substrats semblent rebondir sur et hors de l’enzyme de manière analogue à une balle de ping-pong rebondissant sur une table.
8.4.4. Les enzymes allostériques n’obéissent pas à la cinétique de Michaelis-Menten
Le modèle de Michaelis-Menten a beaucoup aidé au développement de la chimie des enzymes. Ses vertus sont la simplicité et une large applicabilité. Cependant, le modèle de Michaelis-Menten ne peut pas rendre compte des propriétés cinétiques de nombreuses enzymes. Un groupe important d’enzymes qui n’obéissent pas à la cinétique de Michaelis-Menten comprend les enzymes allostériques. Ces enzymes sont constituées de plusieurs sous-unités et de plusieurs sites actifs.
Les enzymes allostériques présentent souvent des tracés sigmoïdaux (figure 8.14) de la vitesse de réaction V0 en fonction de la concentration en substrat , plutôt que les tracés hyperboliques prédits par l’équation de Michaelis-Menten (équation 23). Dans les enzymes allostériques, la liaison du substrat à un site actif peut affecter les propriétés des autres sites actifs de la même molécule enzymatique. Un résultat possible de cette interaction entre les sous-unités est que la liaison du substrat devient coopérative, c’est-à-dire que la liaison du substrat à un site actif de l’enzyme facilite la liaison du substrat aux autres sites actifs. Comme nous le verrons au chapitre 10, une telle coopérativité se traduit par un tracé sigmoïdal de V0 en fonction de . En outre, l’activité d’une enzyme allostérique peut être modifiée par des molécules régulatrices qui sont liées de manière réversible à des sites spécifiques autres que les sites catalytiques. Les propriétés catalytiques des enzymes allostériques peuvent donc être ajustées pour répondre aux besoins immédiats d’une cellule (chapitre 10). Pour cette raison, les enzymes allostériques sont des régulateurs clés des voies métaboliques dans la cellule.
Figure 8.14
Cinétique pour une enzyme allostérique. Les enzymes allostériques présentent une dépendance sigmoïdale de la vitesse de réaction en fonction de la concentration du substrat.