Bookshelf

by admin Leave Comment

Enzymernes primære funktion er at øge reaktionshastigheden, så de er forenelige med organismens behov. For at forstå, hvordan enzymer fungerer, har vi brug for en kinetisk beskrivelse af deres aktivitet. For mange enzymer varierer katalyseringshastigheden V0, der er defineret som antallet af mol produkt, der dannes pr. sekund, med substratkoncentrationen på en måde, der er vist i figur 8.11. Katalysehastigheden stiger lineært, når substratkoncentrationen stiger, og begynder derefter at udjævne sig og nærme sig et maksimum ved højere substratkoncentrationer. Før vi kan fortolke denne graf korrekt, er vi nødt til at forstå, hvordan den er dannet. Overvej et enzym, der katalyserer S til P ad følgende vej:

Omfanget af produktdannelsen bestemmes som en funktion af tiden for en række substratkoncentrationer (figur 8.12). Som forventet stiger mængden af dannet produkt i hvert tilfælde med tiden, selv om der til sidst nås et tidspunkt, hvor der ikke er nogen nettoændring i koncentrationen af S eller P. Enzymet omdanner stadig aktivt substrat til produkt og omvendt, men reaktionsligevægten er nået. Figur 8.13A illustrerer de ændringer i koncentrationen, der observeres i alle reaktionsdeltagerne med tiden, indtil ligevægt er nået.

Figur 8.12

Bestemmelse af begyndelseshastighed. Mængden af produkt, der dannes ved forskellige substratkoncentrationer, er plottet som en funktion af tiden. Initialhastigheden (V0) for hver substratkoncentration bestemmes ud fra kurvens hældning i begyndelsen af (mere…)

Figur 8.13

Ændringer i koncentrationen af reaktionsdeltagere i en enzymkatalyseret reaktion med tiden. Koncentrationsændringer under (A) steady-state-forhold og (B) præ-state-forhold.

Enzymkinetik er nemmere at nærme sig, hvis man kan se bort fra bagreaktionen. Vi definerer V0 som hastigheden af stigningen i produktet med tiden, når er lav; dvs. på tidspunkter tæt på nul (derfor V0) (figur 8.13B). For grafen i figur 8.11 bestemmes V0 således for hver substratkoncentration ved at måle hastigheden af produktdannelsen på tidlige tidspunkter, før P akkumuleres (se figur 8.12).

Vi begynder vores kinetiske undersøgelse af enzymaktivitet med grafen i figur 8.11. Ved en fast koncentration af enzymet er V0 næsten lineært proportional med når er lille, men er næsten uafhængig af når er stor. I 1913 foreslog Leonor Michaelis og Maud Menten en simpel model til at redegøre for disse kinetiske egenskaber. Det kritiske træk i deres behandling er, at et specifikt ES-kompleks er et nødvendigt mellemprodukt i katalysen. Den foreslåede model, som er den enkleste model, der redegør for de kinetiske egenskaber ved mange enzymer, er

Et enzym E kombineres med substrat S for at danne et ES-kompleks med en hastighedskonstant k1. ES-komplekset har to mulige skæbner. Det kan dissocieres til E og S med en hastighedskonstant k-1, eller det kan fortsætte til at danne produktet P med en hastighedskonstant k2. Igen antager vi, at næsten intet af produktet vender tilbage til det oprindelige substrat, hvilket er en betingelse, der gælder i den indledende fase af en reaktion, før koncentrationen af produktet er mærkbar.

Vi ønsker et udtryk, der relaterer katalysehastigheden til koncentrationerne af substrat og enzym og hastigheden af de enkelte trin. Vores udgangspunkt er, at den katalytiske hastighed er lig med produktet af koncentrationen af ES-komplekset og k2.

Nu skal vi udtrykke det i udtryk for kendte størrelser. ES’s dannelses- og nedbrydningshastighed er givet ved:

For at forenkle tingene vil vi arbejde under antagelse af steady-state. I en stationær tilstand forbliver koncentrationerne af mellemprodukter, i dette tilfælde , de samme, selv om koncentrationerne af udgangsmaterialer og produkter ændrer sig. Dette sker, når hastighederne for dannelse og nedbrydning af ES-komplekset er lige store. Ved at sætte højresiderne i ligning 11 og 12 lig med hinanden giver

Ved at omarrangere ligning 13 får vi

Ligning 14 kan forenkles ved at definere en ny konstant, KM, kaldet Michaelis-konstanten:

Bemærk, at KM har koncentrationsenhederne. KM er en vigtig egenskab ved enzym-substrat-interaktioner og er uafhængig af enzym- og substratkoncentrationer.

Insættelse af ligning 15 i ligning 14 og løsning for giver

Nu skal vi undersøge tælleren i ligning 16. Koncentrationen af ukombineret substrat er meget tæt på at være lig med den samlede substratkoncentration, forudsat at koncentrationen af enzym er meget lavere end substratkoncentrationen. Koncentrationen af ukombineret enzym er lig med den samlede enzymkoncentration T minus koncentrationen af ES-komplekset.

Substituerer man dette udtryk for i ligning 16, får man

Løser man ligning 18 for, får man

eller

Gennem at substituere dette udtryk for i ligning 10, får vi

Den maksimale hastighed, Vmax, opnås, når de katalytiske steder på enzymet er mættet med substrat – det vil sige, når = T. Således,

Substituerer man ligning 22 i ligning 21, får man Michaelis-Menten-ligningen:

Denne ligning forklarer de kinetiske data, der er givet i figur 8.11. Ved meget lav substratkoncentration, når er meget mindre end KM, er V0 = (Vmax/KM); det vil sige, at hastigheden er direkte proportional med substratkoncentrationen. Ved høj substratkoncentration, når er meget større end KM, er V0 = Vmax, dvs. hastigheden er maksimal, uafhængig af substratkoncentrationen.

Betydningen af KM fremgår af ligning 23. Når = KM, så er V0 = Vmax/2. KMer således lig med den substratkoncentration, ved hvilken reaktionshastigheden er halvdelen af sin maksimale værdi. KM er en vigtig egenskab ved en enzymkatalyseret reaktion og har betydning for dens biologiske funktion.

Den fysiologiske konsekvens af KM illustreres af visse individers følsomhed over for ethanol. Sådanne personer udviser rødme i ansigtet og hurtig hjertefrekvens (takykardi) efter indtagelse af selv små mængder alkohol. I leveren omdanner alkoholdehydrogenase ethanol til acetaldehyd.

Normalt omdannes acetaldehydet, som er årsag til symptomerne, når det er til stede i høje koncentrationer, til acetat af acetaldehyddehydrogenase.

De fleste mennesker har to former af acetaldehyddehydrogenase, en mitokondriel form med lav KM og en cytosolisk form med høj KM. Hos modtagelige personer er det mitokondrielle enzym mindre aktivt på grund af substitutionen af en enkelt aminosyre, og acetaldehyd behandles kun af det cytosoliske enzym. Da dette enzym har en høj KM, omdannes mindre acetaldehyd til acetat; overskydende acetaldehyd slipper ud i blodet og er ansvarlig for de fysiologiske virkninger.

8.4.1. Betydningen af KM- og Vmax-værdierne

Konceptuel indsigt, enzymkinetik i stationær tilstand

Lær, hvordan de kinetiske parametre KMog Vmaxkan bestemmes eksperimentelt ved hjælp af den enzymkinetiske laboratoriesimulering i dette mediemodul.

Michaelis-konstanten, KM, og den maksimale hastighed, Vmax, kan let udledes af katalysehastigheder målt ved en række forskellige substratkoncentrationer, hvis et enzym fungerer efter det enkle skema, der er angivet i ligning 23. Udledning af KM og Vmax opnås oftest ved hjælp af kurvetilpasningsprogrammer på en computer (se appendiks til dette kapitel for alternative metoder til bestemmelse af KM og Vmax). KM-værdierne for enzymer varierer meget (tabel 8.5). For de fleste enzymer ligger KM mellem 10-1 og 10-7 M. KM-værdien for et enzym afhænger af det pågældende substrat og af miljøforhold som pH, temperatur og ionstyrke. Michaelis-konstanten, KM, har to betydninger. For det første er KM den koncentration af substrat, ved hvilken halvdelen af de aktive steder er fyldt op. KM er således et mål for den substratkoncentration, der kræves, for at der kan ske en betydelig katalyse. For mange enzymer tyder eksperimentelle beviser faktisk på, at KM giver en tilnærmelse af substratkoncentrationen in vivo. Når KM er kendt, kan fraktionen af fyldte sites, fES, ved en hvilken som helst substratkoncentration beregnes ud fra

Tabel 8.5

KM-værdierne for nogle enzymer.

For det andet er KM relateret til hastighedskonstanterne for de enkelte trin i det katalytiske skema, der er angivet i ligning 9. I ligning 15 er KM defineret som (k-1 + k2)/k1. Overvej et begrænsende tilfælde, hvor k-1 er meget større end k2. Under sådanne omstændigheder dissocieres ES-komplekset til E og S meget hurtigere, end der dannes produkt. Under disse betingelser (k-1 >> k2),

Dissociationskonstanten for ES-komplekset er givet ved

Med andre ord er KM lig med dissociationskonstanten for ES-komplekset, hvis k2 er meget mindre end k-1. Når denne betingelse er opfyldt, er KM et mål for styrken af ES-komplekset: en høj KM angiver en svag binding; en lav KM angiver en stærk binding. Det skal understreges, at KM kun angiver ES-kompleksets affinitet, når k-1 er meget større end k2.

Den maksimale hastighed, Vmax, afslører et enzyms omsætningstal, som er antallet af substratmolekyler, der omdannes til produkt af et enzymmolekyle i en tidsenhed, når enzymet er fuldt mættet med substrat. Det er lig med den kinetiske konstant k2, som også kaldes kcat. Den maksimale hastighed, Vmax, afslører et enzyms omsætningsnummer, hvis koncentrationen af aktive steder T er kendt, fordi

og dermed

Til eksempel katalyserer en 10-6 M opløsning af kulsyreanhydrase dannelsen af 0,6 M H2CO3 pr. sekund, når den er fuldt mættet med substrat. Derfor er k2 6 × 105 s-1. Dette omsætningstal er et af de største kendte. Hver katalyseret reaktion finder sted på en tid svarende til 1/k2, hvilket er 1,7 μs for kulsyreanhydrase. Omsætningstallene for de fleste enzymer med deres fysiologiske substrater falder i intervallet fra 1 til 104 pr. sekund (tabel 8.6).

Tabel 8.6

Maximale omsætningstal for nogle enzymer.

8.4.2. Kinetisk perfektion i enzymatisk katalyse: Kriteriet kcat/KM

Når substratkoncentrationen er meget større end KM, er katalyseringshastigheden lig med kcat, omsætningstallet, som beskrevet i afsnit 8.4.1. De fleste enzymer er dog normalt ikke mættet med substrat. Under fysiologiske forhold er /KM-forholdet typisk mellem 0,01 og 1,0. Når << KM er den enzymatiske hastighed meget mindre end kcat, fordi de fleste af de aktive steder er ubesatte. Er der et tal, der karakteriserer kinetikken for et enzym under disse mere typiske cellulære forhold? Det er der bestemt, som det kan vises ved at kombinere ligning 10 og 16 til at give

Når << KM, er koncentrationen af frit enzym, , næsten lig med den samlede koncentration af enzym , så

Dermed afhænger den enzymatiske hastighed, når << KM, af værdierne af kcat/KM, , og T. Under disse betingelser er kcat/KM hastighedskonstanten for vekselvirkningen mellem S og E og kan anvendes som et mål for den katalytiske effektivitet. Ved at anvende kcat/KM-værdierne kan man f.eks. sammenligne et enzyms præference for forskellige substrater. Tabel 8.7 viser kcat/KM-værdierne for flere forskellige substrater for chymotrypsin (afsnit 9.1.1). Chymotrypsin har tydeligvis en præference for at kløve ved siden af voluminøse, hydrofobiske sidekæder.

Tabel 8.7

Substratpræferencer for chymotrypsin.

Hvor effektivt kan et enzym være? Vi kan nærme os dette spørgsmål ved at fastslå, om der er nogen fysiske grænser for værdien af kcat/KM. Bemærk, at dette forhold afhænger af k1, k-1 og kcat, som det kan vises ved at erstatte KM.

Sæt, at hastigheden for dannelse af produkt (kcat) er meget hurtigere end hastigheden for dissociation af ES-komplekset (k-1). Værdien af kcat/KM nærmer sig så k1. Den endelige grænse for værdien af kcat/KM er således fastsat af k1, dvs. dannelseshastigheden for ES-komplekset. Denne hastighed kan ikke være hurtigere end det diffusionskontrollerede møde mellem et enzym og dets substrat. Diffusion begrænser værdien af k1, således at den ikke kan være højere end mellem 108 og 109 s-1 M-1. Derfor er den øvre grænse for kcat/KM mellem 108 og 109 s-1 M-1.

Kcat/KM-forholdet for enzymerne superoxiddismutase, acetylcholinesterase og triosephosphatisomerase er mellem 108 og 109 s-1 M-1. Enzymer som disse, der har kcat/KM-forhold ved de øvre grænser, har opnået kinetisk perfektion. Deres katalytiske hastighed er kun begrænset af den hastighed, hvormed de møder substrat i opløsningen (tabel 8.8). Enhver yderligere forøgelse af den katalytiske hastighed kan kun opnås ved at nedsætte spredningstiden. Husk, at det aktive sted kun er en lille del af den samlede enzymstruktur. Men for katalytisk perfekte enzymer er ethvert møde mellem enzym og substrat produktivt. I disse tilfælde kan der være tiltrækkende elektrostatiske kræfter på enzymet, som lokker substratet til det aktive sted. Disse kræfter omtales undertiden poetisk som Circe-effekter.

Circe-effekt-

Udnyttelse af tiltrækkende kræfter til at lokke et substrat til et sted, hvor det gennemgår en strukturomdannelse, som defineret af William P. Jencks, en enzymolog, der opfandt udtrykket.

En gudinde i den græske mytologi, Circe, lokkede Odysseus’ mænd til sit hus og forvandlede dem derefter til svin.

Tabel 8.8

Enzymer, for hvilke kcat/KM ligger tæt på den diffusionskontrollerede mødesats.

Den begrænsning, som diffusionshastigheden i opløsning medfører, kan også delvist overvindes ved at begrænse substrater og produkter i det begrænsede volumen af et multienzymkompleks. Nogle serier af enzymer er nemlig associeret i organiserede samlinger (afsnit 17.1.9), således at produktet fra et enzym meget hurtigt findes af det næste enzym. I realiteten kanaliseres produkterne fra det ene enzym til det næste, ganske som i et samlebånd.

8.4.3. De fleste biokemiske reaktioner omfatter flere substrater

De fleste reaktioner i biologiske systemer omfatter normalt to substrater og to produkter og kan repræsenteres ved bisubstratreaktionen:

De fleste af disse reaktioner indebærer overførsel af en funktionel gruppe, såsom en fosforyl- eller en ammoniumgruppe, fra det ene substrat til det andet. I oxidations-reduktionsreaktioner overføres elektroner mellem substrater. Reaktioner med flere substrater kan opdeles i to klasser: sekventiel fortrængning og dobbelt fortrængning.

Sekventiel fortrængning

I den sekventielle mekanisme skal alle substrater binde til enzymet, før der frigives et produkt. Følgelig dannes der i en bisubstratreaktion et ternært kompleks af enzymet og begge substrater. Sekventielle mekanismer er af to typer: ordnede, hvor substraterne binder enzymet i en defineret rækkefølge, og tilfældige.

Mange enzymer, der har NAD+ eller NADH som substrat, udviser den sekventielle ordnede mekanisme. Tag laktatdehydrogenase, et vigtigt enzym i glukosemetabolismen, i betragtning (afsnit 16.1.9). Dette enzym reducerer pyruvat til laktat, mens det oxiderer NADH til NAD+.

I den ordnede sekventielle mekanisme binder coenzymet altid først, og laktat frigives altid først. Denne sekvens kan repræsenteres på følgende måde i en notation udviklet af W. Wallace Cleland:

Enzymet eksisterer som et ternært kompleks: først bestående af enzymet og substrater og efter katalysen af enzymet og produkterne.

I den tilfældige sekventielle mekanisme er rækkefølgen af tilsætning af substrater og frigivelse af produkter tilfældig. Sekventielle tilfældige reaktioner illustreres ved dannelsen af fosfokreatin og ADP fra ATP og kreatin, en reaktion, der katalyseres af kreatinkinase (afsnit 14.1.5).

Fosfokreatin er en vigtig energikilde i muskler. Sekventielle tilfældige reaktioner kan også afbildes i Cleland-notationen.

Selv om rækkefølgen af visse begivenheder er tilfældig, passerer reaktionen stadig gennem de ternære komplekser, der først omfatter substrater og derefter produkter.

Dobbelte forskydningsreaktioner (Ping-Pong-reaktioner)

I dobbeltforskydningsreaktioner, eller Ping-Pong-reaktioner, frigøres et eller flere produkter, før alle substrater binder enzymet. Det definerende træk ved dobbeltforskydningsreaktioner er eksistensen af et substitueret enzymmellemprodukt, hvor enzymet er midlertidigt modificeret. Reaktioner, hvor aminogrupper skifter mellem aminosyrer og α-ketosyrer, er klassiske eksempler på dobbeltforskydningsmekanismer. Enzymet aspartataminotransferase (afsnit 23.3.1) katalyserer overførslen af en aminogruppe fra aspartat til α-ketoglutarat.

Hændelsesforløbet kan fremstilles som følgende diagram.

Når aspartat binder sig til enzymet, fjerner enzymet aspartats aminogruppe for at danne det substituerede enzymintermediat. Det første produkt, oxaloacetat, afgår efterfølgende. Det andet substrat, α-ketoglutarat, binder sig til enzymet, accepterer aminogruppen fra det modificerede enzym og frigives derefter som det endelige produkt, glutamat. I Cleland-notationen ser det ud til, at substraterne hopper på og fra enzymet analogt med en bordtennisbold, der hopper på et bord.

8.4.4. Allosteriske enzymer adlyder ikke Michaelis-Menten-kinetik

Michaelis-Menten-modellen har i høj grad hjulpet udviklingen af enzymkemi. Dens fortrin er enkelhed og bred anvendelighed. Michaelis-Menten-modellen kan imidlertid ikke redegøre for de kinetiske egenskaber ved mange enzymer. En vigtig gruppe af enzymer, der ikke adlyder Michaelis-Menten-kinetikken, er de allosteriske enzymer. Disse enzymer består af flere underenheder og flere aktive steder.

Allosteriske enzymer viser ofte sigmoidale plotter (figur 8.14) af reaktionshastigheden V0 over for substratkoncentrationen , snarere end de hyperboliske plotter, som forudsiges af Michaelis-Menten-ligningen (ligning 23). I allosteriske enzymer kan bindingen af substrat til et aktivt sted påvirke egenskaberne af andre aktive steder i det samme enzymmolekyle. Et muligt resultat af denne interaktion mellem underenhederne er, at bindingen af substrat bliver kooperativ, dvs. at bindingen af substrat til et aktivt sted i enzymet letter substratbindingen til de andre aktive steder. Som det vil blive behandlet i kapitel 10, resulterer en sådan kooperativitet i et sigmoideformet plot af V0 i forhold til . Desuden kan aktiviteten af et allosterisk enzym ændres af regulerende molekyler, der reversibelt er bundet til andre specifikke steder end de katalytiske steder. De katalytiske egenskaber ved allosteriske enzymer kan således justeres for at opfylde en celles umiddelbare behov (kapitel 10). Af denne grund er allosteriske enzymer vigtige regulatorer af metaboliske veje i cellen.

Figur 8.14

Kinetik for et allosterisk enzym. Allosteriske enzymer udviser en sigmoidal afhængighed af reaktionshastigheden af substratkoncentrationen.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.