Bookshelf

by admin Leave Comment

Funcția principală a enzimelor este de a mări viteza reacțiilor astfel încât acestea să fie compatibile cu nevoile organismului. Pentru a înțelege cum funcționează enzimele, avem nevoie de o descriere cinetică a activității lor. Pentru multe enzime, rata de cataliză V0, care este definită ca fiind numărul de moli de produs format pe secundă, variază cu concentrația substratului în modul prezentat în figura 8.11. Viteza de cataliză crește liniar pe măsură ce crește concentrația de substrat și apoi începe să se stabilizeze și să se apropie de un maxim la concentrații mai mari de substrat. Înainte de a putea interpreta cu acuratețe acest grafic, trebuie să înțelegem cum este generat. Să considerăm o enzimă care catalizează trecerea de la S la P prin următoarea cale:

Se determină gradul de formare a produsului în funcție de timp pentru o serie de concentrații de substrat (figura 8.12). După cum era de așteptat, în fiecare caz, cantitatea de produs formată crește cu timpul, deși, în cele din urmă, se ajunge la un moment în care nu există nicio modificare netă a concentrației de S sau P. Enzima încă transformă activ substratul în produs și invers, dar echilibrul reacției a fost atins. Figura 8.13A ilustrează modificările de concentrație observate la toți participanții la reacție în funcție de timp până când s-a atins echilibrul.

Figura 8.12

Determinarea vitezei inițiale. Cantitatea de produs formată la diferite concentrații de substrat este reprezentată grafic în funcție de timp. Viteza inițială (V0) pentru fiecare concentrație de substrat se determină din panta curbei la începutul (continuare…)

Figura 8.13

Schimbări în concentrația participanților la reacție a unei reacții catalizate de enzime în funcție de timp. Modificări ale concentrației în (A) condiții de echilibru și (B) condiții de pre-staționare.

Cinetica enzimatică este mai ușor de abordat dacă putem ignora reacția din spate. Definim V0 ca rata de creștere a produsului cu timpul atunci când este mică; adică în momente apropiate de zero (de aici, V0) (figura 8.13B). Astfel, pentru graficul din figura 8.11, V0 se determină pentru fiecare concentrație de substrat prin măsurarea vitezei de formare a produsului în momente timpurii, înainte ca P să se acumuleze (vezi figura 8.12).

Începem examinarea cinetică a activității enzimatice cu graficul prezentat în figura 8.11. La o concentrație fixă de enzimă, V0 este aproape liniar proporțională cu atunci când este mică, dar este aproape independentă de atunci când este mare. În 1913, Leonor Michaelis și Maud Menten au propus un model simplu pentru a explica aceste caracteristici cinetice. Caracteristica critică în tratamentul lor este că un complex ES specific este un intermediar necesar în cataliză. Modelul propus, care este cel mai simplu care dă seama de proprietățile cinetice ale multor enzime, este

O enzimă E se combină cu substratul S pentru a forma un complex ES, cu o constantă de viteză k1. Complexul ES are două destine posibile. Se poate disocia în E și S, cu o constantă de viteză k-1, sau poate continua să formeze produsul P, cu o constantă de viteză k2. Din nou, presupunem că aproape nici un produs nu revine la substratul inițial, o condiție care se menține în stadiul inițial al unei reacții înainte ca concentrația de produs să fie apreciabilă.

Vrem o expresie care să relaționeze viteza de cataliză cu concentrațiile de substrat și enzimă și cu vitezele etapelor individuale. Punctul nostru de plecare este că rata catalitică este egală cu produsul dintre concentrația complexului ES și k2.

Acum trebuie să ne exprimăm în termeni de cantități cunoscute. Vitezele de formare și de descompunere a ES sunt date de:

Pentru a simplifica lucrurile, vom lucra în ipoteza stării de echilibru. Într-o stare staționară, concentrațiile de intermediari, în acest caz , rămân aceleași chiar dacă se modifică concentrațiile materialelor de plecare și ale produselor. Acest lucru se întâmplă atunci când ratele de formare și de descompunere a complexului ES sunt egale. Punând la egalitate părțile drepte ale ecuațiilor 11 și 12 se obține

Rezolvând ecuația 13, obținem

Ecuația 14 poate fi simplificată prin definirea unei noi constante, KM, numită constanta Michaelis:

Rețineți că KM are ca unități de măsură concentrația. KM este o caracteristică importantă a interacțiunilor enzimă-substrat și este independentă de concentrația enzimei și a substratului.

Inserând ecuația 15 în ecuația 14 și rezolvând pentru rezultă

Acum să examinăm numărătorul ecuației 16. Concentrația substratului necombinat este foarte aproape egală cu concentrația totală a substratului, cu condiția ca concentrația enzimei să fie mult mai mică decât cea a substratului. Concentrația de enzimă necombinată este egală cu concentrația totală a enzimei T minus concentrația complexului ES.

Substituind această expresie pentru în ecuația 16 se obține

Soluționând ecuația 18 pentru se obține

sau

Înlocuind această expresie pentru în ecuația 10, obținem

Viteza maximă, Vmax, este atinsă atunci când situsurile catalitice ale enzimei sunt saturate cu substrat – adică atunci când = T. Astfel,

Substituind ecuația 22 în ecuația 21 se obține ecuația Michaelis-Menten:

Această ecuație explică datele cinetice prezentate în figura 8.11. La o concentrație foarte mică a substratului, când este mult mai mică decât KM, V0 = (Vmax/KM); adică viteza este direct proporțională cu concentrația substratului. La o concentrație mare de substrat, când este mult mai mare decât KM, V0 = Vmax; adică, viteza este maximă, independentă de concentrația de substrat.

Semnificația lui KM este evidentă din ecuația 23. Când = KM, atunci V0 = Vmax/2. Astfel, KMeste egală cu concentrația de substrat la care viteza de reacție este la jumătate din valoarea sa maximă. KM este o caracteristică importantă a unei reacții catalizate de o enzimă și este semnificativă pentru funcția sa biologică.

Consecința fiziologică a KM este ilustrată de sensibilitatea unor indivizi la etanol. Astfel de persoane prezintă înroșirea feței și accelerarea ritmului cardiac (tahicardie) după ingerarea chiar și a unor cantități mici de alcool. În ficat, alcool dehidrogenaza transformă etanolul în acetaldehidă.

Normal, acetaldehida, care este cauza simptomelor atunci când este prezentă în concentrații mari, este transformată în acetat de către acetaldehida dehidrogenaza.

Majoritatea oamenilor au două forme de acetaldehidă dehidrogenază, o formă mitocondrială cu KM scăzut și o formă citosolică cu KM ridicat. La persoanele susceptibile, enzima mitocondrială este mai puțin activă din cauza substituirii unui singur aminoacid, iar acetaldehida este procesată doar de enzima citosolică. Deoarece această enzimă are o KM ridicată, mai puțină acetaldehidă este transformată în acetat; excesul de acetaldehidă scapă în sânge și reprezintă efectele fiziologice.

8.4.1. Semnificația valorilor KM și Vmax

Conceptual Insights, Steady-State Enzyme Kinetics

Învățați cum pot fi determinați experimental parametrii cinetici KMși Vmax cu ajutorul simulării de laborator de cinetică enzimatică din acest modul media.

Constanta Michaelis, KM, și viteza maximă, Vmax, pot fi derivate cu ușurință din vitezele de cataliză măsurate la o varietate de concentrații de substrat dacă o enzimă funcționează conform schemei simple prezentate în ecuația 23. Derivarea lui KM și Vmax se realizează cel mai frecvent cu ajutorul programelor de ajustare a curbelor pe calculator (a se vedea apendicele la acest capitol pentru mijloace alternative de determinare a lui KM și Vmax). Valorile KM ale enzimelor variază foarte mult (tabelul 8.5). Pentru majoritatea enzimelor, KM se situează între 10-1 și 10-7 M. Valoarea KM pentru o enzimă depinde de substratul respectiv și de condițiile de mediu, cum ar fi pH-ul, temperatura și forța ionică. Constanta Michaelis, KM, are două semnificații. În primul rând, KM reprezintă concentrația de substrat la care jumătate din situsurile active sunt ocupate. Astfel, KM oferă o măsură a concentrației de substrat necesare pentru ca o cataliză semnificativă să aibă loc. De fapt, pentru multe enzime, dovezile experimentale sugerează că KM oferă o aproximare a concentrației de substrat in vivo. Atunci când KM este cunoscută, fracțiunea de situsuri umplute, fES, la orice concentrație de substrat poate fi calculată din

Tabelul 8.5

Valorile KM ale unor enzime.

În al doilea rând, KM este legat de constantele de viteză ale etapelor individuale din schema catalitică dată în ecuația 9. În ecuația 15, KM este definit ca (k-1 + k2)/k1. Luați în considerare un caz limită în care k-1 este mult mai mare decât k2. În astfel de circumstanțe, complexul ES se disociază în E și S mult mai rapid decât se formează produsul. În aceste condiții (k-1 >> k2),

Constanta de disociere a complexului ES este dată de

Cu alte cuvinte, KMeste egală cu constanta de disociere a complexului ES dacă k2este mult mai mică decât k-1. Atunci când această condiție este îndeplinită, KM este o măsură a puterii complexului ES: o KM mare indică o legătură slabă; o KM mică indică o legătură puternică. Trebuie subliniat faptul că KM indică afinitatea complexului ES numai atunci când k-1 este mult mai mare decât k2.

Viteza maximă, Vmax, dezvăluie numărul de rotație al unei enzime, care este numărul de molecule de substrat transformate în produs de către o moleculă de enzimă într-o unitate de timp, atunci când enzima este complet saturată cu substrat. Acesta este egal cu constanta cinetică k2, care se mai numește și kcat. Viteza maximă, Vmax, relevă numărul de rotație al unei enzime dacă se cunoaște concentrația situsurilor active T, deoarece

și astfel

De exemplu, o soluție de 10-6 M de anhidrază carbonică catalizează formarea a 0,6 M H2CO3 pe secundă atunci când este complet saturată cu substrat. Prin urmare, k2 este de 6 × 105 s-1. Acest număr de rotație este unul dintre cele mai mari cunoscute. Fiecare reacție catalizată are loc într-un timp egal cu 1/k2, care este de 1,7 μs pentru anhidraza carbonică. Numerele de rotație ale majorității enzimelor cu substraturile lor fiziologice se încadrează în intervalul de la 1 la 104 pe secundă (tabelul 8.6).

Tabel 8.6

Numerele maxime de rotație ale unor enzime.

8.4.2. Perfecțiunea cinetică în cataliza enzimatică: Criteriul kcat/KM

Când concentrația substratului este mult mai mare decât KM, viteza de cataliză este egală cu kcat, numărul de rotație, așa cum este descris în secțiunea 8.4.1. Cu toate acestea, majoritatea enzimelor nu sunt în mod normal saturate cu substrat. În condiții fiziologice, raportul /KM este de obicei cuprins între 0,01 și 1,0. Atunci când << KM, rata enzimatică este mult mai mică decât kcat, deoarece majoritatea situsurilor active sunt neocupate. Există un număr care să caracterizeze cinetica unei enzime în aceste condiții celulare mai tipice? Într-adevăr, există, după cum se poate demonstra prin combinarea ecuațiilor 10 și 16 pentru a obține

Când << KM, concentrația de enzimă liberă, , este aproape egală cu concentrația totală a enzimei , deci

Atunci, când << KM, viteza enzimatică depinde de valorile lui kcat/KM, , și T. În aceste condiții, kcat/KM este constanta de viteză pentru interacțiunea dintre S și E și poate fi utilizată ca o măsură a eficienței catalitice. De exemplu, prin utilizarea valorilor kcat/KM, se poate compara preferința unei enzime pentru diferite substraturi. Tabelul 8.7 prezintă valorile kcat/KM pentru mai multe substraturi diferite ale chimotripsinei (secțiunea 9.1.1). Chimotripsina are în mod clar o preferință pentru clivarea lângă lanțurile laterale voluminoase și hidrofobe.

Tabel 8.7

Preferințele de substrat ale chimotripsinei.

Cât de eficientă poate fi o enzimă? Putem aborda această întrebare determinând dacă există limite fizice asupra valorii lui kcat/KM. Rețineți că acest raport depinde de k1, k-1 și kcat, după cum se poate arăta prin înlocuirea lui KM.

Să presupunem că viteza de formare a produsului (kcat) este mult mai rapidă decât viteza de disociere a complexului ES (k-1). Valoarea lui kcat/KM se apropie atunci de k1. Astfel, limita ultimă a valorii lui kcat/KM este stabilită de k1, viteza de formare a complexului ES. Această viteză nu poate fi mai rapidă decât întâlnirea, controlată prin difuzie, dintre o enzimă și substratul său. Difuzia limitează valoarea lui k1 astfel încât aceasta nu poate fi mai mare de 108-109 s-1 M-1. Prin urmare, limita superioară a raportului kcat/KM este cuprinsă între 108 și 109 s-1 M-1.

Raporturile kcat/KM ale enzimelor superoxid dismutaza, acetilcolinesterază și triose fosfat izomeraza sunt cuprinse între 108 și 109 s-1 M-1. Enzimele ca acestea care au rapoarte kcat/KM la limitele superioare au atins perfecțiunea cinetică. Viteza lor catalitică este limitată doar de viteza cu care întâlnesc substratul în soluție (tabelul 8.8). Orice creștere suplimentară a vitezei catalitice poate veni doar prin scăderea timpului de difuzie. Rețineți că situsul activ este doar o mică parte din structura totală a enzimei. Cu toate acestea, pentru enzimele perfecte din punct de vedere catalitic, fiecare întâlnire între enzimă și substrat este productivă. În aceste cazuri, pot exista forțe electrostatice atractive asupra enzimei care să atragă substratul către situsul activ. Aceste forțe sunt uneori denumite poetic efecte Circe.

Efectul Circe-

Utilizarea forțelor atractive pentru a atrage un substrat într-un situs în care acesta suferă o transformare de structură, așa cum a fost definit de William P. Jencks, un enzimolog, care a inventat termenul.

O zeiță din mitologia greacă, Circe i-a ademenit pe oamenii lui Ulise în casa ei și apoi i-a transformat în porci.

Tabel 8.8

Enzime pentru care kcat/KM este apropiat de viteza de întâlnire controlată prin difuzie.

Limita impusă de viteza de difuzie în soluție poate fi, de asemenea, parțial depășită prin izolarea substraturilor și a produșilor în volumul limitat al unui complex multienzimatic. Într-adevăr, unele serii de enzime sunt asociate în ansambluri organizate (secțiunea 17.1.9), astfel încât produsul unei enzime este găsit foarte rapid de următoarea enzimă. De fapt, produsele sunt canalizate de la o enzimă la alta, la fel ca într-o linie de asamblare.

8.4.3. Majoritatea reacțiilor biochimice includ substraturi multiple

Majoritatea reacțiilor din sistemele biologice includ, de obicei, două substraturi și doi produși și pot fi reprezentate prin reacția bisubstrat:

Majoritatea acestor reacții implică transferul unei grupări funcționale, cum ar fi o grupare fosforil sau o grupare amoniu, de la un substrat la celălalt. În reacțiile de oxidare-reducere, electronii sunt transferați între substraturi. Reacțiile cu substraturi multiple pot fi împărțite în două clase: deplasare secvențială și dublă deplasare.

Dezplasare secvențială

În mecanismul secvențial, toate substraturile trebuie să se lege de enzimă înainte de a se elibera orice produs. În consecință, într-o reacție cu bisubstrat, se formează un complex ternar format din enzimă și ambele substraturi. Mecanismele secvențiale sunt de două tipuri: ordonate, în care substraturile se leagă de enzimă într-o secvență definită, și aleatorii.

Multe enzime care au ca substrat NAD+ sau NADH prezintă mecanismul secvențial ordonat. Luați în considerare lactat dehidrogenaza, o enzimă importantă în metabolismul glucozei (secțiunea 16.1.9). Această enzimă reduce piruvatul în lactat în timp ce oxidează NADH în NAD+.

În mecanismul secvențial ordonat, coenzima se leagă întotdeauna prima și lactatul este întotdeauna eliberat primul. Această secvență poate fi reprezentată după cum urmează, într-o notație dezvoltată de W. Wallace Cleland:

Enzima există ca un complex ternar: mai întâi, format din enzimă și substraturi și, după cataliză, din enzimă și produși.

În mecanismul secvențial aleatoriu, ordinea de adăugare a substraturilor și de eliberare a produselor este aleatorie. Reacțiile secvențiale aleatorii sunt ilustrate de formarea fosfocreatinei și a ADP din ATP și creatină, reacție catalizată de creatin kinaza (secțiunea 14.1.5).

Fosfocreatina este o sursă importantă de energie în mușchi. Reacțiile secvențiale aleatorii pot fi, de asemenea, reprezentate în notația Cleland.

Deși ordinea anumitor evenimente este aleatorie, reacția trece totuși prin complexele ternare care includ, mai întâi, substraturi și, apoi, produși.

Reacții de dublă deplasare (Ping-Pong)

În reacțiile de dublă deplasare, sau Ping-Pong, unul sau mai mulți produși sunt eliberați înainte ca toate substraturile să se lege de enzimă. Caracteristica definitorie a reacțiilor de dublă deplasare este existența unui intermediar enzimatic substituit, în care enzima este modificată temporar. Reacțiile care transferă grupări amino între aminoacizi și α-cetoacizi sunt exemple clasice de mecanisme de dublă deplasare. Enzima aspartat aminotransferaza (secțiunea 23.3.1) catalizează transferul unei grupări amino de la aspartat la α-cetoglutarat.

Succesiunea evenimentelor poate fi reprezentată în următoarea diagramă.

După ce aspartatul se leagă de enzimă, aceasta îndepărtează gruparea amino a aspartatului pentru a forma intermediarul enzimatic substituit. Primul produs, oxaloacetatul, pleacă ulterior. Al doilea substrat, α-cetoglutaratul, se leagă de enzimă, acceptă grupa amino din enzima modificată și este apoi eliberat ca produs final, glutamatul. În notația Cleland, substraturile par să sară pe și de pe enzimă în mod analog cu o minge de ping-pong care sare pe o masă.

8.4.4. Enzimele alosterice nu se supun cineticii Michaelis-Menten

Modelul Michaelis-Menten a ajutat foarte mult la dezvoltarea chimiei enzimelor. Virtuțile sale sunt simplitatea și aplicabilitatea largă. Cu toate acestea, modelul Michaelis-Menten nu poate explica proprietățile cinetice ale multor enzime. Un grup important de enzime care nu se supun cineticii Michaelis-Menten cuprinde enzimele alosterice. Aceste enzime sunt alcătuite din mai multe subunități și mai multe situsuri active.

Enzimele alosterice prezintă adesea diagrame sigmoidale (figura 8.14) ale vitezei de reacție V0 în funcție de concentrația de substrat , mai degrabă decât diagramele hiperbolice prezise de ecuația Michaelis-Menten (ecuația 23). În cazul enzimelor alosterice, legarea substratului la un situs activ poate afecta proprietățile altor situsuri active din aceeași moleculă enzimatică. Un rezultat posibil al acestei interacțiuni între subunități este că legarea substratului devine cooperantă; adică, legarea substratului la un situs activ al enzimei facilitează legarea substratului la celelalte situsuri active. După cum va fi analizat în capitolul 10, o astfel de cooperativitate are ca rezultat un grafic sigmoidal al lui V0 în funcție de . În plus, activitatea unei enzime alosterice poate fi modificată de moleculele de reglare care sunt legate în mod reversibil la situsuri specifice, altele decât situsurile catalitice. Proprietățile catalitice ale enzimelor alosterice pot fi astfel ajustate pentru a satisface nevoile imediate ale unei celule (capitolul 10). Din acest motiv, enzimele alosterice sunt regulatori cheie ai căilor metabolice din celulă.

Figura 8.14

Cinetica pentru o enzimă alosterică. Enzimele alosterice prezintă o dependență sigmoidală a vitezei de reacție de concentrația substratului.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.