La funzione primaria degli enzimi è quella di aumentare i tassi delle reazioni in modo che siano compatibili con le esigenze dell’organismo. Per capire come funzionano gli enzimi, abbiamo bisogno di una descrizione cinetica della loro attività. Per molti enzimi, il tasso di catalisi V0, che è definito come il numero di moli di prodotto formate al secondo, varia con la concentrazione del substrato in un modo mostrato nella figura 8.11. Il tasso di catalisi aumenta linearmente all’aumentare della concentrazione del substrato e poi comincia a livellarsi e ad avvicinarsi a un massimo a concentrazioni di substrato più alte. Prima di poter interpretare accuratamente questo grafico, dobbiamo capire come si genera. Consideriamo un enzima che catalizza da S a P attraverso il seguente percorso:
- Figura 8.11
- Figura 8.12
- Figura 8.13
- 8.4.1. Il significato dei valori di KM e Vmax
- Antuizioni concettuali, cinetica enzimatica a stato stazionario
- Tabella 8.5
- Tabella 8.6
- 8.4.2. Perfezione cinetica nella catalisi enzimatica: Il criterio kcat/KM
- Tabella 8.7
- Effetto Circe-
- Tabella 8.8
- 8.4.3. La maggior parte delle reazioni biochimiche include più substrati
- Spostamento sequenziale
- Reazioni a doppio spostamento (Ping-Pong)
- 8.4.4. Gli enzimi allosterici non obbediscono alla cinetica di Michaelis-Menten
- Figura 8.14
Figura 8.11
Cinetica di Michaelis-Menten. Un grafico della velocità di reazione (V0) in funzione della concentrazione del substrato per un enzima che obbedisce alla cinetica di Michaelis-Menten mostra che la velocità massima (Vmax) si avvicina asintoticamente. La costante di Michaelis (più…)
Il grado di formazione del prodotto è determinato in funzione del tempo per una serie di concentrazioni di substrato (Figura 8.12). Come previsto, in ogni caso, la quantità di prodotto formato aumenta con il tempo, anche se alla fine si raggiunge un momento in cui non vi è alcun cambiamento netto nella concentrazione di S o P. L’enzima sta ancora convertendo attivamente il substrato in prodotto e viceversa, ma l’equilibrio di reazione è stato raggiunto. La figura 8.13A illustra i cambiamenti di concentrazione osservati in tutti i partecipanti alla reazione con il tempo fino a quando l’equilibrio è stato raggiunto.
Figura 8.12
Determinazione della velocità iniziale. La quantità di prodotto formato a diverse concentrazioni di substrato è tracciata in funzione del tempo. La velocità iniziale (V0) per ogni concentrazione di substrato è determinata dalla pendenza della curva all’inizio di (continua…)
Figura 8.13
Cambiamenti nella concentrazione dei partecipanti alla reazione di una reazione catalizzata da enzimi con il tempo. Variazioni di concentrazione in (A) condizioni di stato stazionario, e (B) le condizioni di pre-stato stazionario.
La cinetica enzimatica è più facilmente avvicinabile se possiamo ignorare la reazione di ritorno. Definiamo V0 come il tasso di aumento del prodotto con il tempo quando è basso; cioè, in tempi vicini allo zero (quindi, V0) (Figura 8.13B). Così, per il grafico in figura 8.11, V0 è determinato per ogni concentrazione di substrato misurando il tasso di formazione del prodotto nei primi tempi prima che P si accumuli (vedi figura 8.12).
Iniziamo il nostro esame cinetico dell’attività enzimatica con il grafico mostrato in figura 8.11. A una concentrazione fissa di enzima, V0 è quasi linearmente proporzionale a quando è piccolo ma è quasi indipendente da quando è grande. Nel 1913, Leonor Michaelis e Maud Menten proposero un semplice modello per rendere conto di queste caratteristiche cinetiche. La caratteristica critica nel loro trattamento è che un complesso ES specifico è un intermedio necessario nella catalisi. Il modello proposto, che è il più semplice che rende conto delle proprietà cinetiche di molti enzimi, è
Un enzima E si combina con il substrato S per formare un complesso ES, con una costante di tasso k1. Il complesso ES ha due possibili destini. Può dissociarsi in E e S, con una costante di velocità k-1, o può procedere a formare il prodotto P, con una costante di velocità k2. Ancora una volta, assumiamo che quasi nessuno del prodotto ritorni al substrato iniziale, una condizione che si mantiene nella fase iniziale di una reazione prima che la concentrazione del prodotto sia apprezzabile.
Vogliamo un’espressione che metta in relazione la velocità di catalisi con le concentrazioni di substrato ed enzima e le velocità dei singoli passi. Il nostro punto di partenza è che la velocità catalitica è uguale al prodotto della concentrazione del complesso ES e k2.
Ora dobbiamo esprimere in termini di quantità note. I tassi di formazione e decomposizione di ES sono dati da:
Per semplificare le cose, lavoreremo nell’ipotesi di stato stazionario. In uno stato stazionario, le concentrazioni degli intermedi, in questo caso, rimangono le stesse anche se le concentrazioni dei materiali di partenza e dei prodotti cambiano. Questo si verifica quando i tassi di formazione e decomposizione del complesso ES sono uguali. Mettendo i lati destri delle equazioni 11 e 12 uguali si ottiene
Riadattando l’equazione 13, si ottiene
L’equazione 14 può essere semplificata definendo una nuova costante, KM, chiamata costante di Michaelis:
Nota che KM ha le unità di concentrazione. KM è una caratteristica importante delle interazioni enzima-substrato ed è indipendente dalle concentrazioni dell’enzima e del substrato.
Inserendo l’equazione 15 nell’equazione 14 e risolvendo si ottiene
Esaminiamo ora il numeratore dell’equazione 16. La concentrazione del substrato non combinato è quasi uguale alla concentrazione totale del substrato, a condizione che la concentrazione dell’enzima sia molto più bassa di quella del substrato. La concentrazione dell’enzima non combinato è uguale alla concentrazione totale dell’enzima T meno la concentrazione del complesso ES.
Sostituendo questa espressione per nell’equazione 16 dà
Solvendo l’equazione 18 per dà
o
Sostituendo questa espressione per nell’equazione 10, otteniamo
La velocità massima, Vmax, è raggiunta quando i siti catalitici dell’enzima sono saturi di substrato, cioè quando = T. Così,
Sostituendo l’equazione 22 nell’equazione 21 si ottiene l’equazione di Michaelis-Menten:
Questa equazione spiega i dati cinetici riportati nella figura 8.11. A una concentrazione di substrato molto bassa, quando è molto inferiore a KM, V0 = (Vmax/KM); cioè, la velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato. Ad alta concentrazione di substrato, quando è molto maggiore di KM, V0 = Vmax; cioè, il tasso è massimo, indipendente dalla concentrazione del substrato.
Il significato di KM è evidente dall’equazione 23. Quando = KM, allora V0 = Vmax/2. Così, KM è uguale alla concentrazione di substrato alla quale la velocità di reazione è la metà del suo valore massimo. Il KM è una caratteristica importante di una reazione catalizzata da un enzima ed è significativo per la sua funzione biologica.
La conseguenza fisiologica del KM è illustrata dalla sensibilità di alcuni individui all’etanolo. Tali persone mostrano arrossamento del viso e ritmo cardiaco rapido (tachicardia) dopo aver ingerito anche piccole quantità di alcol. Nel fegato, l’alcol deidrogenasi converte l’etanolo in acetaldeide.
Normalmente, l’acetaldeide, che è la causa dei sintomi quando è presente ad alte concentrazioni, viene trasformata in acetato dall’acetaldeide deidrogenasi.
La maggior parte delle persone ha due forme di acetaldeide deidrogenasi, una forma mitocondriale a basso KM e una forma citosolica ad alto KM. Nelle persone suscettibili, l’enzima mitocondriale è meno attivo a causa della sostituzione di un singolo amminoacido, e l’acetaldeide viene processata solo dall’enzima citosolico. Dato che questo enzima ha un alto KM, meno acetaldeide viene convertita in acetato; l’acetaldeide in eccesso sfugge nel sangue ed è responsabile degli effetti fisiologici.
8.4.1. Il significato dei valori di KM e Vmax
Antuizioni concettuali, cinetica enzimatica a stato stazionario
Impara come i parametri cinetici KM e Vmax possono essere determinati sperimentalmente usando la simulazione di laboratorio di cinetica enzimatica in questo modulo.
La costante di Michaelis, KM, e il tasso massimo, Vmax, possono essere facilmente derivati dai tassi di catalisi misurati a una varietà di concentrazioni di substrato se un enzima opera secondo il semplice schema dato dall’equazione 23. La derivazione di KM e Vmax è più comunemente ottenuta con l’uso di programmi di adattamento delle curve su un computer (vedi l’appendice di questo capitolo per mezzi alternativi di determinazione di KM e Vmax). I valori di KM degli enzimi variano ampiamente (Tabella 8.5). Per la maggior parte degli enzimi, il KM è compreso tra 10-1 e 10-7 M. Il valore KM per un enzima dipende dal particolare substrato e dalle condizioni ambientali come il pH, la temperatura e la forza ionica. La costante di Michaelis, KM, ha due significati. In primo luogo, KM è la concentrazione di substrato alla quale metà dei siti attivi sono riempiti. Quindi, KM fornisce una misura della concentrazione di substrato necessaria per una catalisi significativa. Infatti, per molti enzimi, l’evidenza sperimentale suggerisce che il KM fornisce un’approssimazione della concentrazione di substrato in vivo. Quando il KM è noto, la frazione di siti riempiti, fES, a qualsiasi concentrazione di substrato può essere calcolata da
Tabella 8.5
valori KM di alcuni enzimi.
In secondo luogo, KM è legato alle costanti di velocità dei singoli passi nello schema catalitico dato nell’equazione 9. Nell’equazione 15, KM è definito come (k-1 + k2)/k1. Consideriamo un caso limite in cui k-1 è molto maggiore di k2. In tali circostanze, il complesso ES si dissocia in E e S molto più rapidamente di quanto non si formi il prodotto. In queste condizioni (k-1 >> k2),
La costante di dissociazione del complesso ES è data da
In altre parole, KM è uguale alla costante di dissociazione del complesso ES se k2 è molto minore di k-1. Quando questa condizione è soddisfatta, KM è una misura della forza del complesso ES: un alto KM indica un legame debole; un basso KM indica un legame forte. Bisogna sottolineare che KM indica l’affinità del complesso ES solo quando k-1 è molto maggiore di k2.
La velocità massima, Vmax, rivela il numero di turnover di un enzima, che è il numero di molecole di substrato convertite in prodotto da una molecola di enzima in un tempo unitario quando l’enzima è completamente saturo di substrato. È uguale alla costante cinetica k2, chiamata anche kcat. Il tasso massimo, Vmax, rivela il numero di turnover di un enzima se la concentrazione dei siti attivi T è nota, perché
e quindi
Per esempio, una soluzione 10-6 M di anidrasi carbonica catalizza la formazione di 0,6 M H2CO3 al secondo quando è completamente satura di substrato. Quindi, k2 è 6 × 105 s-1. Questo numero di fatturato è uno dei più grandi conosciuti. Ogni reazione catalizzata avviene in un tempo pari a 1/k2, che è 1,7 μs per l’anidrasi carbonica. I numeri di turnover della maggior parte degli enzimi con i loro substrati fisiologici rientrano nell’intervallo da 1 a 104 al secondo (Tabella 8.6).
Tabella 8.6
Numeri massimi di turnover di alcuni enzimi.
8.4.2. Perfezione cinetica nella catalisi enzimatica: Il criterio kcat/KM
Quando la concentrazione del substrato è molto maggiore di KM, la velocità di catalisi è uguale a kcat, il numero di turnover, come descritto nella sezione 8.4.1. Tuttavia, la maggior parte degli enzimi non sono normalmente saturi di substrato. In condizioni fisiologiche, il rapporto /KM è tipicamente tra 0,01 e 1,0. Quando << KM, il tasso enzimatico è molto inferiore a kcat perché la maggior parte dei siti attivi non sono occupati. Esiste un numero che caratterizza la cinetica di un enzima in queste condizioni cellulari più tipiche? In effetti c’è, come si può dimostrare combinando le equazioni 10 e 16 per dare
Quando << KM, la concentrazione di enzima libero, , è quasi uguale alla concentrazione totale di enzima, quindi
Quindi, quando << KM, la velocità enzimatica dipende dai valori di kcat/KM, , e T. In queste condizioni, kcat/KM è la costante di velocità per l’interazione di S ed E e può essere usata come misura dell’efficienza catalitica. Per esempio, usando i valori di kcat/KM, si può confrontare la preferenza di un enzima per diversi substrati. La tabella 8.7 mostra i valori kcat/KM per diversi substrati di chimotripsina (sezione 9.1.1). La chimotripsina ha chiaramente una preferenza per la scissione vicino a catene laterali voluminose e idrofobiche.
Tabella 8.7
Preferenze di substrato della chimotripsina.
Quanto efficiente può essere un enzima? Possiamo affrontare questa domanda determinando se ci sono dei limiti fisici sul valore di kcat/KM. Si noti che questo rapporto dipende da k1, k-1 e kcat, come può essere mostrato sostituendo KM.
Supponiamo che la velocità di formazione del prodotto (kcat) sia molto più veloce della velocità di dissociazione del complesso ES (k-1). Il valore di kcat/KM si avvicina allora a k1. Così, il limite ultimo del valore di kcat/KM è fissato da k1, il tasso di formazione del complesso ES. Questo tasso non può essere più veloce dell’incontro controllato dalla diffusione di un enzima e del suo substrato. La diffusione limita il valore di k1 in modo che non possa essere più alto di 108 e 109 s-1 M-1. Quindi, il limite superiore di kcat/KM è tra 108 e 109 s-1 M-1.
I rapporti kcat/KM degli enzimi superossido dismutasi, acetilcolinesterasi e triosio fosfato isomerasi sono tra 108 e 109 s-1 M-1. Enzimi come questi che hanno rapporti kcat/KM ai limiti superiori hanno raggiunto la perfezione cinetica. La loro velocità catalitica è limitata solo dalla velocità con cui incontrano il substrato nella soluzione (Tabella 8.8). Qualsiasi ulteriore guadagno nella velocità catalitica può venire solo diminuendo il tempo di diffusione. Ricordate che il sito attivo è solo una piccola parte della struttura totale dell’enzima. Eppure, per enzimi cataliticamente perfetti, ogni incontro tra enzima e substrato è produttivo. In questi casi, ci possono essere forze elettrostatiche attraenti sull’enzima che attirano il substrato al sito attivo. Queste forze sono talvolta chiamate poeticamente effetti Circe.
Effetto Circe-
L’utilizzo di forze attrattive per attirare un substrato in un sito in cui subisce una trasformazione della struttura, come definito da William P. Jencks, un enzimologo, che ha coniato il termine.
Dea della mitologia greca, Circe attirò gli uomini di Ulisse nella sua casa e poi li trasformò in maiali.
Tabella 8.8
Enzimi per i quali kcat/KM è vicino alla velocità di incontro controllata dalla diffusione.
Il limite imposto dalla velocità di diffusione in soluzione può anche essere parzialmente superato confinando substrati e prodotti nel volume limitato di un complesso multienzimatico. Infatti, alcune serie di enzimi sono associate in assemblaggi organizzati (Sezione 17.1.9) in modo che il prodotto di un enzima sia trovato molto rapidamente dall’enzima successivo. In effetti, i prodotti sono incanalati da un enzima al successivo, proprio come in una catena di montaggio.
8.4.3. La maggior parte delle reazioni biochimiche include più substrati
La maggior parte delle reazioni nei sistemi biologici di solito include due substrati e due prodotti e può essere rappresentata dalla reazione bisubstrato:
La maggior parte di tali reazioni comporta il trasferimento di un gruppo funzionale, come un fosforile o un gruppo ammonio, da un substrato all’altro. Nelle reazioni di ossido-riduzione, gli elettroni sono trasferiti tra i substrati. Le reazioni a substrato multiplo possono essere divise in due classi: spostamento sequenziale e doppio spostamento.
Spostamento sequenziale
Nel meccanismo sequenziale, tutti i substrati devono legarsi all’enzima prima che qualsiasi prodotto venga rilasciato. Di conseguenza, in una reazione bisubstrato, si forma un complesso ternario dell’enzima e di entrambi i substrati. I meccanismi sequenziali sono di due tipi: ordinati, in cui i substrati si legano all’enzima in una sequenza definita, e casuali.
Molti enzimi che hanno NAD+ o NADH come substrato mostrano il meccanismo sequenziale ordinato. Consideriamo la lattato deidrogenasi, un importante enzima nel metabolismo del glucosio (Sezione 16.1.9). Questo enzima riduce il piruvato a lattato mentre ossida NADH a NAD+.
Nel meccanismo sequenziale ordinato, il coenzima si lega sempre per primo e il lattato viene sempre rilasciato per primo. Questa sequenza può essere rappresentata come segue in una notazione sviluppata da W. Wallace Cleland:
L’enzima esiste come un complesso ternario: prima, costituito dall’enzima e dai substrati e, dopo la catalisi, dall’enzima e dai prodotti.
Nel meccanismo sequenziale casuale, l’ordine di aggiunta dei substrati e di rilascio dei prodotti è casuale. Le reazioni casuali sequenziali sono illustrate dalla formazione di fosfocreatina e ADP da ATP e creatina, una reazione catalizzata dalla creatina chinasi (Sezione 14.1.5).
La fosfocreatina è un’importante fonte di energia nei muscoli. Le reazioni casuali sequenziali possono anche essere rappresentate nella notazione di Cleland.
Anche se l’ordine di certi eventi è casuale, la reazione passa ancora attraverso i complessi ternari che includono, prima, i substrati e, poi, i prodotti.
Reazioni a doppio spostamento (Ping-Pong)
Nelle reazioni a doppio spostamento, o Ping-Pong, uno o più prodotti vengono rilasciati prima che tutti i substrati leghino l’enzima. La caratteristica che definisce le reazioni di doppio-spostamento è l’esistenza di un intermedio enzimatico sostituito, in cui l’enzima è temporaneamente modificato. Le reazioni che scambiano gruppi amminici tra aminoacidi e α-chetoacidi sono esempi classici di meccanismi di doppio-spostamento. L’enzima aspartato aminotransferasi (Sezione 23.3.1) catalizza il trasferimento di un gruppo amminico dall’aspartato all’α-chetoglutarato.
La sequenza degli eventi può essere rappresentata nel seguente diagramma.
Dopo che l’aspartato si lega all’enzima, l’enzima rimuove il gruppo amminico dell’aspartato per formare l’intermedio enzimatico sostituito. Il primo prodotto, l’ossalacetato, parte successivamente. Il secondo substrato, l’α-chetoglutarato, si lega all’enzima, accetta il gruppo amminico dall’enzima modificato e viene poi rilasciato come prodotto finale, il glutammato. Nella notazione di Cleland, i substrati sembrano rimbalzare su e fuori l’enzima analogamente a una pallina da ping-pong che rimbalza su un tavolo.
8.4.4. Gli enzimi allosterici non obbediscono alla cinetica di Michaelis-Menten
Il modello di Michaelis-Menten ha aiutato molto lo sviluppo della chimica degli enzimi. Le sue virtù sono la semplicità e l’ampia applicabilità. Tuttavia, il modello di Michaelis-Menten non può spiegare le proprietà cinetiche di molti enzimi. Un importante gruppo di enzimi che non obbediscono alla cinetica di Michaelis-Menten comprende gli enzimi allosterici. Questi enzimi consistono di più subunità e più siti attivi.
Gli enzimi allosterici spesso mostrano diagrammi sigmoidali (Figura 8.14) della velocità di reazione V0 rispetto alla concentrazione del substrato, piuttosto che i diagrammi iperbolici previsti dall’equazione di Michaelis-Menten (equazione 23). Negli enzimi allosterici, il legame del substrato a un sito attivo può influenzare le proprietà di altri siti attivi nella stessa molecola enzimatica. Un possibile risultato di questa interazione tra le subunità è che il legame del substrato diventa cooperativo; cioè, il legame del substrato a un sito attivo dell’enzima facilita il legame del substrato agli altri siti attivi. Come verrà considerato nel capitolo 10, tale cooperatività si traduce in un grafico sigmoidale di V0 rispetto a . Inoltre, l’attività di un enzima allosterico può essere alterata da molecole regolatrici che sono reversibilmente legate a siti specifici diversi da quelli catalitici. Le proprietà catalitiche degli enzimi allosterici possono quindi essere regolate per soddisfare le esigenze immediate di una cellula (Capitolo 10). Per questo motivo, gli enzimi allosterici sono regolatori chiave delle vie metaboliche nella cellula.
Figura 8.14
Cinetiche per un enzima allosterico. Gli enzimi allosterici mostrano una dipendenza sigmoidale della velocità di reazione dalla concentrazione del substrato.