Az enzimek elsődleges feladata a reakciók sebességének növelése, hogy azok összeegyeztethetők legyenek a szervezet igényeivel. Ahhoz, hogy megértsük az enzimek működését, szükségünk van aktivitásuk kinetikai leírására. Sok enzim esetében a katalízis sebessége V0, amelyet a másodpercenként képződött termék mólszámaként határozunk meg, a szubsztrátkoncentrációval a 8.11. ábrán látható módon változik. A katalízis sebessége a szubsztrátkoncentráció növekedésével lineárisan emelkedik, majd magasabb szubsztrátkoncentrációknál kezd kiegyenlítődni és megközelíteni a maximumot. Mielőtt pontosan értelmezhetnénk ezt a grafikont, meg kell értenünk, hogyan keletkezik. Tekintsünk egy olyan enzimet, amely a következő úton katalizálja az S-ről P-re történő átmenetet:
- 8.11. ábra
- 8.12. ábra
- 8.13
- 8.4.1. A KM és Vmax értékek jelentősége
- Koncepcionális betekintés, állandósult állapotú enzimkinetika
- Táblázat 8.5
- 8.6. táblázat
- 8.4.2. Kinetikai tökéletesség az enzimatikus katalízisben: A kcat/KM kritérium
- 8.7. táblázat
- Circe-effektus-
- 8.8. táblázat
- 8.4.3. Az egyik enzim a másikhoz vezet. A legtöbb biokémiai reakció több szubsztrátot tartalmaz
- Sekvenciális kiszorítás
- Kettős elmozdulású (Ping-Pong) reakciók
- 8.4.4. Az alloszterikus enzimek nem engedelmeskednek a Michaelis-Menten kinetikának
- 8.14. ábra
8.11. ábra
Michaelis-Menten kinetika. A Michaelis-Menten-kinetikának engedelmeskedő enzim reakciósebességének (V0) ábrázolása a szubsztrátkoncentráció függvényében azt mutatja, hogy a maximális sebesség (Vmax) aszimptotikusan közeledik. A Michaelis-állandó (tovább…)
A termékképződés mértékét az idő függvényében határozzuk meg egy sor szubsztrátkoncentrációra (8.12. ábra). A várakozásoknak megfelelően minden esetben a képződött termék mennyisége növekszik az idővel, bár végül elérkezik egy olyan időpont, amikor nincs nettó változás az S vagy a P koncentrációjában. Az enzim még mindig aktívan alakítja át a szubsztrátot termékké és fordítva, de a reakció egyensúlya már beállt. A 8.13A ábra szemlélteti a reakció valamennyi résztvevőjénél megfigyelhető koncentrációváltozást az idő múlásával az egyensúly eléréséig.
8.12. ábra
A kezdeti sebesség meghatározása. A különböző szubsztrátkoncentrációk mellett képződött termék mennyiségét ábrázoljuk az idő függvényében. Az egyes szubsztrátkoncentrációkhoz tartozó kezdeti sebességet (V0) a görbe meredekségéből határozzuk meg a (tovább…)
8.13
Az enzimkatalizált reakció résztvevőinek koncentrációjának változása az idő függvényében. A koncentráció változása (A) állandósult állapotú körülmények között és (B) az állandósult állapot előtti körülmények között.
Az enzimkinetika könnyebben megközelíthető, ha figyelmen kívül hagyhatjuk a visszareakciót. A V0-t úgy definiáljuk, mint a termék növekedési sebességét az idővel, amikor alacsony; vagyis a nulla közeli időpontokban (ezért V0) (8.13B ábra). Így a 8.11. ábrán látható grafikon esetében a V0-t minden szubsztrátkoncentrációra úgy határozzuk meg, hogy a termékképződés sebességét mérjük a P felhalmozódása előtti korai időpontokban (lásd a 8.12. ábrát).
Az enzimaktivitás kinetikai vizsgálatát a 8.11. ábrán látható grafikonnal kezdjük. Fix enzimkoncentráció mellett a V0 majdnem lineárisan arányos azzal, amikor kicsi, de majdnem független attól, amikor nagy. 1913-ban Leonor Michaelis és Maud Menten egy egyszerű modellt javasoltak e kinetikai jellemzők magyarázatára. Kezelésük kritikus jellemzője, hogy egy specifikus ES-komplex szükséges köztes termék a katalízisben. A javasolt modell, amely a legegyszerűbb modell, amely számos enzim kinetikai tulajdonságait magyarázza, a következő
Egy E enzim S szubsztráttal egyesülve ES-komplexet képez, k1 sebességállandóval. Az ES-komplexnek két lehetséges sorsa van. Dissociálhat E-re és S-re, k-1 sebességállandóval, vagy folytatódhat P termék képződésével, k2 sebességállandóval. Ismét feltételezzük, hogy a termékből szinte semmi sem tér vissza a kiindulási szubsztrátba, ez a feltétel a reakció kezdeti szakaszában érvényesül, mielőtt a termék koncentrációja érzékelhetővé válik.
Keresünk egy olyan kifejezést, amely a katalízis sebességét a szubsztrát és az enzim koncentrációjával és az egyes lépések sebességével hozza összefüggésbe. Kiindulópontunk az, hogy a katalitikus sebesség egyenlő az ES-komplex koncentrációjának és k2 szorzatával.
Most ismert mennyiségekben kell kifejeznünk. Az ES képződési és bomlási sebességét a következők adják:
A dolgok egyszerűsítése érdekében az állandósult állapot feltételezésével fogunk dolgozni. Állandósult állapotban a köztitermékek koncentrációja, ebben az esetben , akkor is változatlan marad, ha a kiindulási anyagok és a termékek koncentrációja változik. Ez akkor következik be, ha az ES-komplex képződésének és lebomlásának sebessége egyenlő. A 11. és 12. egyenlet jobb oldalait egyenlővé téve
A 13. egyenlet átrendezésével megkapjuk
A 14. egyenlet egyszerűsíthető egy új konstans, a KM, az úgynevezett Michaelis-állandó meghatározásával:
Megjegyezzük, hogy a KM a koncentráció egysége. A KM az enzim-szubsztrát kölcsönhatások fontos jellemzője, és független az enzim- és a szubsztrátkoncentrációtól.
A 15. egyenletet a 14. egyenletbe beillesztve és megoldva megkapjuk
Most vizsgáljuk meg a 16. egyenlet számlálóját. A kombinálatlan szubsztrát koncentrációja nagyon közel azonos a teljes szubsztrátkoncentrációval, feltéve, hogy az enzim koncentrációja sokkal kisebb, mint a szubsztráté. A kombinálatlan enzim koncentrációja egyenlő a T teljes enzimkoncentrációval mínusz az ES komplex koncentrációja.
Ezt a kifejezést a 16. egyenletbe behelyettesítve
A 18. egyenletet megoldva
vagy
Ezt a kifejezést a 10. egyenletbe behelyettesítve, megkapjuk
A maximális sebesség, Vmax, akkor érhető el, amikor az enzim katalitikus helyei telítettek szubsztráttal – vagyis amikor = T. Így,
A 22. egyenletet a 21. egyenletbe behelyettesítve megkapjuk a Michaelis-Menten-egyenletet:
Ez az egyenlet magyarázza a 8.11. ábrán látható kinetikai adatokat. Nagyon alacsony szubsztrátkoncentráció esetén, amikor sokkal kisebb, mint a KM, V0 = (Vmax/KM); vagyis a sebesség egyenesen arányos a szubsztrátkoncentrációval. Nagy szubsztrátkoncentráció esetén, amikor a KM-nél sokkal nagyobb, V0 = Vmax; azaz a sebesség maximális, a szubsztrátkoncentrációtól független.
A KM jelentése a 23. egyenletből nyilvánvaló. Ha = KM, akkor V0 = Vmax/2. Így a KM egyenlő azzal a szubsztrátkoncentrációval, amelynél a reakciósebesség a maximális érték felét éri el. A KM egy enzimkatalizált reakció fontos jellemzője, és jelentős a biológiai funkció szempontjából.
A KM fiziológiai következményét szemlélteti egyes egyedek etanol iránti érzékenysége. Az ilyen személyeknél arcpír és gyors szívverés (tachycardia) jelentkezik még kis mennyiségű alkohol elfogyasztása után is. A májban az alkohol-dehidrogenáz az etanolt acetaldehiddé alakítja át.
Normális esetben az acetaldehidet, amely nagy koncentrációban jelenlétében a tüneteket okozza, az acetaldehid-dehidrogenáz acetáttá dolgozza fel.
A legtöbb embernél az acetaldehid-dehidrogenáznak két formája van, egy alacsony KM-értékű mitokondriális forma és egy magas KM-értékű citoszolikus forma. Az arra fogékony személyeknél a mitokondriális enzim egyetlen aminosav kicserélődése miatt kevésbé aktív, és az acetaldehidet csak a citoszolikus enzim dolgozza fel. Mivel ennek az enzimnek magas a KM-je, kevesebb acetaldehid alakul át acetáttá; a felesleges acetaldehid a vérbe kerül, és ez felelős az élettani hatásokért.
8.4.1. A KM és Vmax értékek jelentősége
Koncepcionális betekintés, állandósult állapotú enzimkinetika
Tanulja meg, hogyan lehet a KMés Vmax kinetikai paramétereket kísérletileg meghatározni az enzimkinetika laboratóriumi szimuláció segítségével ebben a média modulban.
A Michaelis-állandó, KM, és a maximális sebesség, Vmax, könnyen levezethető a különböző szubsztrátkoncentrációk mellett mért katalízisrátákból, ha egy enzim a 23. egyenletben megadott egyszerű séma szerint működik. A KM és a Vmax meghatározását leggyakrabban számítógépes görbeillesztő programok segítségével lehet elvégezni (a KM és a Vmax meghatározásának alternatív módjait lásd e fejezet függelékében). Az enzimek KM-értékei széles skálán mozognak (8.5. táblázat). A legtöbb enzim esetében a KM érték 10-1 és 10-7 M között van. Az enzim KM értéke függ az adott szubsztráttól és a környezeti feltételektől, például a pH-tól, a hőmérséklettől és az ionerősségtől. A Michaelis-állandónak, a KM-nek két jelentése van. Először is, a KM az a szubsztrátkoncentráció, amelynél az aktív helyek fele betöltődik. Így a KM a jelentős katalízishez szükséges szubsztrátkoncentráció mértékét adja meg. Valójában számos enzim esetében a kísérleti bizonyítékok arra utalnak, hogy a KM közelíti a szubsztrátkoncentrációt in vivo. Ha a KM ismert, a betöltött helyek frakciója, fES, bármely szubsztrátkoncentráció mellett kiszámítható
Táblázat 8.5
Néhány enzim KM értékeiből.
Második, a KM a 9. egyenletben megadott katalitikus séma egyes lépéseinek sebességállandóihoz kapcsolódik. A 15. egyenletben a KM a következőképpen van meghatározva: (k-1 + k2)/k1. Tekintsünk egy olyan határesetet, amelyben k-1 sokkal nagyobb, mint k2. Ilyen körülmények között az ES-komplex sokkal gyorsabban disszociál E-re és S-re, mint ahogyan termék képződik. Ilyen körülmények között (k-1 >> k2),
Az ES-komplex disszociációs állandója
Más szóval a KM egyenlő az ES-komplex disszociációs állandójával, ha k2 sokkal kisebb, mint k-1. Ha ez a feltétel teljesül, a KM az ES-komplex erősségének mérőszáma: a magas KM gyenge kötődést, az alacsony KM erős kötődést jelez. Hangsúlyozni kell, hogy a KM csak akkor jelzi az ES-komplex affinitását, ha a k-1 sokkal nagyobb, mint a k2.
A maximális sebesség, a Vmax, felfedi az enzim turnoverszámát, amely az enzimmolekula által egységnyi idő alatt termékké alakított szubsztrátmolekulák száma, amikor az enzim teljesen telítve van szubsztráttal. Ez egyenlő a k2 kinetikai állandóval, amelyet kcat-nak is neveznek. A maximális sebesség, Vmax, elárulja egy enzim forgalmi számát, ha ismert a T aktív hely koncentrációja, mert
és így
Egy 10-6 M oldatú szénsavanhidráz például 0,6 M H2CO3 képződését katalizálja másodpercenként, ha teljesen telített a szubsztráttal. Ezért a k2 6 × 105 s-1. Ez a fordulatszám az egyik legnagyobb ismert. Minden katalizált reakció 1/k2-nek megfelelő idő alatt megy végbe, ami a szénsavanhidráz esetében 1,7 μs. A legtöbb enzim forgalmi száma fiziológiás szubsztrátjaikkal a másodpercenkénti 1 és 104 közé esik (8.6. táblázat).
8.6. táblázat
Maximális forgalmi számok egyes enzimeknél.
8.4.2. Kinetikai tökéletesség az enzimatikus katalízisben: A kcat/KM kritérium
Ha a szubsztrátkoncentráció jóval nagyobb, mint a KM, akkor a katalízis sebessége megegyezik a 8.4.1. szakaszban leírt kcat, azaz a turnover számmal. A legtöbb enzim azonban általában nem telítődik szubsztráttal. Fiziológiás körülmények között a /KM arány jellemzően 0,01 és 1,0 között van. Amikor << KM, az enzimsebesség sokkal kisebb, mint a kcat, mivel az aktív helyek többsége nem foglalt. Van-e olyan szám, amely jellemzi egy enzim kinetikáját ilyen tipikusabb sejtkörülmények között? Valóban van, amint azt a 10. és 16. egyenlet kombinálásával megmutathatjuk, hogy
Ha << KM, akkor a szabad enzim koncentrációja, , majdnem egyenlő az enzim teljes koncentrációjával, tehát
Ezért, ha << KM, az enzimsebesség a kcat/KM, , és T értékektől függ. Ilyen körülmények között a kcat/KM az S és az E kölcsönhatásának sebességi állandója, és a katalitikus hatékonyság mérőszámaként használható. A kcat/KM értékek segítségével például össze lehet hasonlítani egy enzim különböző szubsztrátok iránti preferenciáját. A 8.7. táblázat a kimotripszin (9.1.1. szakasz) több különböző szubsztrátjának kcat/KM értékeit mutatja. A kimotripszin egyértelműen előnyben részesíti a terjedelmes, hidrofób oldalláncok melletti hasítást.
8.7. táblázat
A kimotripszin szubsztrátpreferenciái.
Milyen hatékony lehet egy enzim? Ezt a kérdést úgy közelíthetjük meg, hogy meghatározzuk, vannak-e fizikai határai a kcat/KM értékének. Megjegyezzük, hogy ez az arány függ a k1, k-1 és kcat értékektől, amit a KM helyettesítésével mutathatunk ki.
Tegyük fel, hogy a termékképződés sebessége (kcat) sokkal gyorsabb, mint az ES komplex disszociációs sebessége (k-1). Ekkor a kcat/KM értéke megközelíti a k1 értéket. Így a kcat/KM értékének végső határát a k1, az ES-komplex képződési sebessége szabja meg. Ez a sebesség nem lehet gyorsabb, mint az enzim és a szubsztrát diffúzióvezérelt találkozása. A diffúzió korlátozza a k1 értékét, így az nem lehet magasabb, mint 108 és 109 s-1 M-1 közötti érték. Ezért a kcat/KM felső határa 108 és 109 s-1 M-1 között van.
A szuperoxid-dizmutáz, az acetil-kolinészteráz és a trióz-foszfát izomeráz enzimek kcat/KM arányai 108 és 109 s-1 M-1 között vannak. Az ilyen enzimek, amelyek kcat/KM-aránya a felső határon van, elérték a kinetikai tökéletességet. Katalitikus sebességüket csak az a sebesség korlátozza, amellyel az oldatban szubsztráttal találkoznak (8.8. táblázat). A katalitikus sebesség további növekedése csak a diffúziós idő csökkentésével érhető el. Ne feledjük, hogy az aktív centrum a teljes enzimszerkezetnek csak egy kis része. Mégis, a katalitikusan tökéletes enzimek esetében az enzim és a szubsztrát minden találkozása produktív. Ezekben az esetekben az enzimre vonzó elektrosztatikus erők hathatnak, amelyek a szubsztrátot az aktív centrumba csalogatják. Ezeket az erőket néha költőien Circe-effektusnak nevezik.
Circe-effektus-
A vonzó erők kihasználása a szubsztrát olyan helyre csalogatására, ahol a szubsztrát szerkezeti átalakuláson megy keresztül, ahogyan William P. Jencks enzimológus, a kifejezés megalkotója meghatározta.
A görög mitológia istennője, Circe Odüsszeusz embereit házába csalta, majd disznóvá változtatta őket.
8.8. táblázat
Enzimek, amelyeknél a kcat/KM közel van a diffúzióvezérelt találkozási sebességhez.
Az oldatban történő diffúzió sebessége által szabott korlátot részben úgy is le lehet küzdeni, hogy a szubsztrátokat és a termékeket egy multienzimkomplex korlátozott térfogatába zárjuk. Valóban, egyes enzimsorozatok szervezett együttesekbe kapcsolódnak (17.1.9. szakasz), így az egyik enzim termékét a következő enzim nagyon gyorsan megtalálja. Valójában a termékek az egyik enzimtől a következőhöz csatornázódnak, hasonlóan egy futószalaghoz.
8.4.3. Az egyik enzim a másikhoz vezet. A legtöbb biokémiai reakció több szubsztrátot tartalmaz
A legtöbb reakció a biológiai rendszerekben általában két szubsztrátot és két terméket tartalmaz, és a biszubsztrátreakcióval ábrázolható:
Az ilyen reakciók többsége egy funkciós csoport, például egy foszforil- vagy ammóniumcsoport átvitelével jár az egyik szubsztrátról a másikra. Az oxidációs-redukciós reakciókban elektronok kerülnek át a szubsztrátok között. A többszörös szubsztrát reakciók két osztályba sorolhatók: szekvenciális kiszorítás és kettős kiszorítás.
Sekvenciális kiszorítás
A szekvenciális mechanizmusban minden szubsztrátnak meg kell kötődnie az enzimhez, mielőtt bármilyen termék felszabadulna. Következésképpen egy biszubsztrát reakcióban az enzim és mindkét szubsztrát terner komplexe képződik. A szekvenciális mechanizmusoknak két típusa van: a rendezett, amelyben a szubsztrátok meghatározott sorrendben kötődnek az enzimhez, és a véletlenszerű.
Sok enzim, amelynek szubsztrátja NAD+ vagy NADH, a szekvenciális rendezett mechanizmust mutatja. Tekintsük a laktát-dehidrogenázt, a glükóz-anyagcsere egyik fontos enzimjét (16.1.9. szakasz). Ez az enzim a piruvátot laktáttá redukálja, miközben a NADH-t NAD+ -vá oxidálja.
A rendezett szekvenciális mechanizmusban a koenzim mindig először kötődik, és a laktát mindig először szabadul fel. Ez a sorrend a következőképpen ábrázolható a W. Wallace Cleland által kifejlesztett jelöléssel:
Az enzim hármas komplexként létezik: először az enzimből és a szubsztrátokból, majd a katalízis után az enzimből és a termékekből áll.
A véletlenszerű szekvenciális mechanizmusban a szubsztrátok hozzáadásának és a termékek felszabadításának sorrendje véletlenszerű. A szekvenciális véletlenszerű reakciókat a kreatinkináz által katalizált foszfokreatin és ADP képződése ATP-ből és kreatinból szemlélteti (14.1.5. szakasz).
A foszfokreatin fontos energiaforrás az izomban. A szekvenciális véletlenszerű reakciókat a Cleland-féle jelöléssel is ábrázolhatjuk.
Bár bizonyos események sorrendje véletlenszerű, a reakció mégis a terner komplexeken keresztül halad, beleértve először a szubsztrátokat, majd a termékeket.
Kettős elmozdulású (Ping-Pong) reakciók
A kettős elmozdulású vagy Ping-Pong-reakciókban egy vagy több termék szabadul fel, mielőtt az összes szubsztrát megkötné az enzimet. A kettős kiszorítási reakciók meghatározó jellemzője egy szubsztituált enzim intermedier létezése, amelyben az enzim átmenetileg módosul. Az aminosavak és α-ketosavak között aminocsoportokat cserélő reakciók klasszikus példái a kettős kiszorítási mechanizmusoknak. Az aszpartát-aminotranszferáz enzim (23.3.1. szakasz) katalizálja az aminocsoport átvitelét az aszpartátról az α-ketoglutarátra.
Az események sorrendje az alábbi ábrán ábrázolható.
Az aszpartát enzimhez való kötődése után az enzim eltávolítja az aszpartát aminocsoportját, hogy a szubsztituált enzimintermedier keletkezzen. Az első termék, az oxalacetát ezt követően távozik. A második szubsztrát, az α-ketoglutarát, kötődik az enzimhez, felveszi az aminocsoportot a módosított enzimről, majd végtermékként, glutamátként szabadul fel. A Cleland-féle jelölés szerint a szubsztrátok úgy tűnik, mintha az asztalon pattogó ping-pong labdához hasonlóan pattognának az enzimre és vissza.
8.4.4. Az alloszterikus enzimek nem engedelmeskednek a Michaelis-Menten kinetikának
A Michaelis-Menten-modell nagyban segítette az enzimkémia fejlődését. Erényei az egyszerűség és a széleskörű alkalmazhatóság. A Michaelis-Menten-modell azonban sok enzim kinetikai tulajdonságait nem tudja figyelembe venni. Az enzimek fontos csoportját, amelyek nem engedelmeskednek a Michaelis-Menten-kinetikának, az alloszterikus enzimek alkotják. Ezek az enzimek több alegységből és több aktív helyből állnak.
Az alloszterikus enzimek gyakran a V0 reakciósebesség és a szubsztrátkoncentráció függvényében a Michaelis-Menten-egyenlet (23. egyenlet) által megjósolt hiperbolikus ábrák helyett inkább szigmoidális ábrákat (8.14. ábra) mutatnak. Az alloszterikus enzimekben a szubsztrátnak az egyik aktív helyhez való kötődése befolyásolhatja ugyanazon enzimmolekula más aktív helyeinek tulajdonságait. Az alegységek közötti kölcsönhatás egyik lehetséges eredménye, hogy a szubsztrátkötés kooperatívvá válik, azaz a szubsztrátnak az enzim egyik aktív helyére történő kötődése elősegíti a szubsztrátnak a többi aktív helyhez történő kötődését. Amint azt a 10. fejezetben megvizsgáljuk, az ilyen kooperativitás a V0 függvényében egy szigmoidális diagramot eredményez. Ezenkívül egy alloszterikus enzim aktivitását megváltoztathatják olyan szabályozó molekulák, amelyek a katalitikus helyektől eltérő specifikus helyeken reverzibilisen kötődnek. Az alloszterikus enzimek katalitikus tulajdonságai így a sejt közvetlen igényeihez igazíthatók (10. fejezet). Emiatt az alloszterikus enzimek a sejt anyagcsereútjainak kulcsfontosságú szabályozói.
8.14. ábra
Az alloszterikus enzim kinetikája. Az alloszterikus enzimek a reakciósebesség szubsztrátkoncentrációtól való szigmoidális függését mutatják.