Kirjahylly

by admin Leave Comment

Ensi sijassa entsyymien tehtävänä on tehostaa reaktioiden nopeutta niin, että ne ovat sopusoinnussa eliön tarpeiden kanssa. Ymmärtääksemme, miten entsyymit toimivat, tarvitsemme kineettisen kuvauksen niiden aktiivisuudesta. Monien entsyymien katalyysinopeus V0, joka määritellään sekunnissa muodostuvien tuotemoolien määränä, vaihtelee substraattikonsentraation mukaan kuvassa 8.11 esitetyllä tavalla. Katalyysinopeus nousee lineaarisesti substraattikonsentraation kasvaessa ja alkaa sitten tasaantua ja lähestyä maksimia suuremmilla substraattikonsentraatioilla. Ennen kuin voimme tulkita tätä kuvaajaa tarkasti, meidän on ymmärrettävä, miten se syntyy. Tarkastellaan entsyymiä, joka katalysoi S:stä P:ksi seuraavaa reittiä:

Tuotteen muodostumisen laajuus määritetään ajan funktiona sarjalle substraattikonsentraatioita (kuva 8.12). Odotetusti jokaisessa tapauksessa muodostuvan tuotteen määrä kasvaa ajan myötä, vaikka lopulta saavutetaan aika, jolloin S:n tai P:n konsentraatiossa ei tapahdu nettomuutosta. Entsyymi muuttaa edelleen aktiivisesti substraattia tuotteeksi ja päinvastoin, mutta reaktiotasapaino on saavutettu. Kuvassa 8.13A havainnollistetaan kaikkien reaktion osallistujien konsentraatiomuutoksia ajan myötä, kunnes tasapaino on saavutettu.

Kuva 8.12

Alkunopeuden määrittäminen. Eri substraattipitoisuuksilla muodostuneen tuotteen määrä on piirretty ajan funktiona. Alkunopeus (V0) kullekin substraattikonsentraatiolle määritetään käyrän kaltevuudesta alussa (lisää…)

Kuva 8.13

Entsyymikatalysoidun reaktion osallistujien konsentraation muuttuminen ajan funktiona. Konsentraatiomuutokset (A) vakaan tilan olosuhteissa ja (B) ennen vakaan tilan olosuhteita.

Entsyymikiinetiikkaa on helpompi lähestyä, jos voimme sivuuttaa vastareaktion. Määrittelemme V0:n tuotteen kasvunopeudeksi ajan funktiona silloin, kun se on pieni; toisin sanoen aikoina, jotka ovat lähellä nollaa (siis V0) (kuva 8.13B). Näin ollen kuvan 8.11 kuvaajalle määritetään V0 kullekin substraattikonsentraatiolle mittaamalla tuotteen muodostumisnopeus varhaisina aikoina ennen P:n kertymistä (ks. kuva 8.12).

Aloitamme entsyymiaktiivisuuden kineettisen tarkastelun kuvan 8.11 kuvaajalla. Kiinteällä entsyymikonsentraatiolla V0 on lähes lineaarisesti verrannollinen, kun on pieni, mutta on lähes riippumaton, kun on suuri. Vuonna 1913 Leonor Michaelis ja Maud Menten ehdottivat yksinkertaista mallia näiden kineettisten ominaisuuksien selittämiseksi. Kriittinen piirre heidän käsittelyssään on se, että tietty ES-kompleksi on välttämätön välituote katalyysissä. Ehdotettu malli, joka on yksinkertaisin monien entsyymien kineettisiä ominaisuuksia selittävä malli, on

Ensiymi E yhdistyy substraatin S kanssa muodostaen ES-kompleksin, jonka nopeusvakio on k1. ES-kompleksilla on kaksi mahdollista kohtaloa. Se voi dissosioitua E:ksi ja S:ksi, jolloin nopeusvakio on k-1, tai se voi edetä muodostaen tuotteen P, jolloin nopeusvakio on k2. Oletamme jälleen, että lähes mikään tuotteesta ei palaudu alkuperäiseksi substraatiksi, mikä on edellytys, joka vallitsee reaktion alkuvaiheessa ennen kuin tuotteen pitoisuus on huomattava.

Haluamme lausekkeen, joka suhteuttaa katalyysin nopeuden substraatin ja entsyymin pitoisuuksiin ja yksittäisten vaiheiden nopeuksiin. Lähtökohtamme on, että katalyysinopeus on yhtä suuri kuin ES-kompleksin konsentraation ja k2:n tulo.

Jatkossa meidän on ilmaistava tunnettujen suureiden suhteen. ES:n muodostumis- ja hajoamisnopeudet saadaan:

Yksinkertaistaaksemme asiaa työskentelemme tasaista tilaa koskevan oletuksen mukaisesti. Tasaisessa tilassa välituotteiden, tässä tapauksessa , pitoisuudet pysyvät samoina, vaikka lähtöaineiden ja tuotteiden pitoisuudet muuttuvat. Tämä tapahtuu, kun ES-kompleksin muodostumis- ja hajoamisnopeudet ovat yhtä suuret. Kun yhtälöiden 11 ja 12 oikeat puolet asetetaan yhtä suuriksi, saadaan

Sijoittamalla yhtälö 13 uudelleen saadaan

Yhtälöä 14 voidaan yksinkertaistaa määrittelemällä uusi vakio KM, jota kutsutaan Michaelis-vakioksi:

Huomaa, että KM:llä on konsentraation yksiköt. KM on tärkeä ominaisuus entsyymin ja substraatin vuorovaikutuksille, ja se on riippumaton entsyymin ja substraatin konsentraatioista.

Sijoittamalla yhtälö 15 yhtälöön 14 ja ratkaisemalla se saadaan

Tarkastellaan nyt yhtälön 16 osoittajaa. Yhdistämättömän substraatin konsentraatio on hyvin lähellä substraatin kokonaiskonsentraatiota edellyttäen, että entsyymin konsentraatio on paljon pienempi kuin substraatin. Yhdistämättömän entsyymin konsentraatio on yhtä suuri kuin entsyymin kokonaiskonsentraatio T miinus ES-kompleksin konsentraatio.

Substituoimalla tämä lauseke for yhtälöön 16 saadaan

Yhtälön 18 ratkaiseminen for antaa

tai

Substituoimalla tämä lauseke for yhtälöön 10, saadaan

Maksiminopeus, Vmax, saavutetaan, kun entsyymin katalyyttiset kohdat ovat kyllästyneet substraatilla eli kun = T. Näin ollen,

Substituoimalla yhtälö 22 yhtälöön 21 saadaan Michaelis-Mentenin yhtälö:

Tämä yhtälö selittää kuvassa 8.11 esitetyt kineettiset tiedot. Hyvin alhaisella substraattikonsentraatiolla, kun se on paljon pienempi kuin KM, V0 = (Vmax/KM); toisin sanoen nopeus on suoraan verrannollinen substraattikonsentraatioon. Suurella substraattikonsentraatiolla, kun se on paljon suurempi kuin KM, V0 = Vmax; eli nopeus on maksimaalinen, substraattikonsentraatiosta riippumaton.

KM:n merkitys käy ilmi yhtälöstä 23. Kun = KM, niin V0 = Vmax/2. KM on siis yhtä suuri kuin substraattikonsentraatio, jolla reaktionopeus on puolet maksimiarvostaan. KM on entsyymin katalysoiman reaktion tärkeä ominaisuus ja sillä on merkitystä sen biologisen toiminnan kannalta.

KM:n fysiologista seurausta havainnollistaa joidenkin yksilöiden herkkyys etanolille. Tällaisilla henkilöillä esiintyy kasvojen punoitusta ja nopeaa sykettä (takykardiaa) pienenkin alkoholimäärän nauttimisen jälkeen. Maksassa alkoholidehydrogenaasi muuttaa etanolin asetaldehydiksi.

Normaalisti asetaldehydi, joka suurina pitoisuuksina esiintyessään aiheuttaa oireita, prosessoidaan asetaldehydidehydrogenaasin avulla asetaatiksi.

Useimmilla ihmisillä on asetaldehydidehydrogenaasista kaksi muotoa, matalan KM:n mitokondriaalinen muoto ja korkean KM:n sytosolinen muoto. Alttiilla henkilöillä mitokondriaalinen entsyymi on vähemmän aktiivinen yhden aminohapon korvautumisen vuoksi, ja asetaldehydiä prosessoi vain sytosolinen entsyymi. Koska tällä entsyymillä on korkea KM, vähemmän asetaldehydiä muuttuu asetaatiksi; ylimääräinen asetaldehydi karkaa vereen ja aiheuttaa fysiologisia vaikutuksia.

8.4.1. Fysiologiset vaikutukset. KM- ja Vmax-arvojen merkitys

Käsitteellinen oivallus, Steady-State Enzyme Kinetics

Opi, miten kineettiset parametrit KMja Vmaxvoidaan määrittää kokeellisesti tämän mediamoduulin entsyymikineettisen laboratoriosimulaation avulla.

Michaelis-vakio, KM, ja maksiminopeus, Vmax, voidaan helposti johtaa eri substraattipitoisuuksilla mitatuista katalyysinopeuksista, jos entsyymi toimii yhtälössä 23 esitetyn yksinkertaisen kaavan mukaisesti. KM:n ja Vmax:n johtaminen onnistuu tavallisimmin tietokoneen käyränsovitusohjelmien avulla (ks. tämän luvun liite, jossa käsitellään vaihtoehtoisia tapoja määrittää KM ja Vmax). Entsyymien KM-arvot vaihtelevat suuresti (taulukko 8.5). Useimpien entsyymien KM-arvo on välillä 10-1-10-7 M. Entsyymin KM-arvo riippuu tietystä substraatista ja ympäristöolosuhteista, kuten pH:sta, lämpötilasta ja ionivahvuudesta. Michaelis-vakiolla, KM, on kaksi merkitystä. Ensinnäkin KM on substraattikonsentraatio, jolla puolet aktiivisista paikoista täyttyy. Näin ollen KM on mitta sille substraattikonsentraatiolle, joka tarvitaan merkittävän katalyysin aikaansaamiseksi. Itse asiassa monien entsyymien osalta kokeelliset todisteet viittaavat siihen, että KM antaa likimääräisen arvion substraattikonsentraatiosta in vivo. Kun KM tunnetaan, täytettyjen paikkojen osuus, fES, millä tahansa substraattikonsentraatiolla voidaan laskea

Taulukko 8.5

joidenkin entsyymien KM-arvoista.

Toiseksi KM liittyy yhtälössä 9 esitettyyn katalyyttisen kaavan yksittäisten vaiheiden nopeusvakioihin. Yhtälössä 15 KM määritellään (k-1 + k2)/k1. Tarkastellaan rajatapausta, jossa k-1 on paljon suurempi kuin k2. Tällöin ES-kompleksi dissosioituu E:ksi ja S:ksi paljon nopeammin kuin tuotetta muodostuu. Näissä olosuhteissa (k-1 >> k2),

ES-kompleksin dissosiaatiovakio on

Muulla sanoen KMon yhtä suuri kuin ES-kompleksin dissosiaatiovakio, jos k2on paljon pienempi kuin k-1. Kun tämä ehto täyttyy, KM on ES-kompleksin vahvuuden mitta: suuri KM osoittaa heikkoa sitoutumista; pieni KM osoittaa vahvaa sitoutumista. On korostettava, että KM osoittaa ES-kompleksin affiniteetin vain silloin, kun k-1 on paljon suurempi kuin k2.

Maksiminopeus, Vmax, paljastaa entsyymin liikevaihtoluvun, joka on niiden substraattimolekyylien lukumäärä, jotka entsyymimolekyyli muuttaa tuotteeksi aikayksikössä, kun entsyymi on täysin kyllästynyt substraatilla. Se on yhtä suuri kuin kineettinen vakio k2, jota kutsutaan myös nimellä kcat. Maksiminopeus Vmax paljastaa entsyymin liikevaihtoluvun, jos aktiivisten paikkojen T konsentraatio tunnetaan, koska

ja näin ollen

Esimerkiksi 10-6 M:n liuos hiilihappoanhydraasia katalysoi 0,6 M H2CO3:n muodostumista sekunnissa, kun se on täysin kyllästynyt substraatilla. Näin ollen k2 on 6 × 105 s-1. Tämä liikevaihtoluku on yksi suurimmista tunnetuista. Jokainen katalysoitu reaktio tapahtuu ajassa, joka on yhtä suuri kuin 1/k2 eli hiilihappoanhydraasilla 1,7 μs. Useimpien entsyymien liikevaihtoluvut fysiologisten substraattiensa kanssa ovat välillä 1-104 sekunnissa (taulukko 8.6).

Taulukko 8.6

Joidenkin entsyymien suurimmat liikevaihtoluvut.

8.4.2. Kineettinen täydellisyys entsymaattisessa katalyysissä: Kcat/KM-kriteeri

Kun substraattikonsentraatio on paljon suurempi kuin KM, katalyysin nopeus on yhtä suuri kuin kcat, liikevaihtoluku, kuten kohdassa 8.4.1 on kuvattu. Useimmat entsyymit eivät kuitenkaan normaalisti ole substraatin kyllästämiä. Fysiologisissa olosuhteissa /KM-suhde on tyypillisesti välillä 0,01-1,0. Kun << KM, entsyyminopeus on paljon pienempi kuin kcat, koska suurin osa aktiivisista paikoista on miehittämättömiä. Onko olemassa jokin luku, joka luonnehtii entsyymin kinetiikkaa näissä tyypillisemmissä soluolosuhteissa? Näissä olosuhteissa kcat/KM on S:n ja E:n vuorovaikutuksen nopeusvakio, ja sitä voidaan käyttää katalyyttisen tehokkuuden mittarina. Käyttämällä kcat/KM-arvoja voidaan esimerkiksi verrata entsyymin mieltymystä eri substraatteihin. Taulukossa 8.7 esitetään kcat/KM-arvot useille kymotrypsiinin eri substraateille (kohta 9.1.1). Kymotrypsiinillä on selvästi mieltymys pilkkoa tilaa vievien, hydrofobisten sivuketjujen vieressä.

Taulukko 8.7

Kymotrypsiinin substraattipreferenssit.

Miten tehokas entsyymi voi olla? Voimme lähestyä tätä kysymystä määrittämällä, onko kcat/KM:n arvolle olemassa fysikaalisia rajoja. Huomaa, että tämä suhde riippuu k1:stä, k-1:stä ja kcat:sta, kuten voidaan osoittaa korvaamalla KM:llä.

Esitellään, että tuotteen muodostumisnopeus (kcat) on paljon nopeampi kuin ES-kompleksin dissosiaationopeus (k-1). Tällöin kcat/KM:n arvo lähestyy k1:tä. Näin ollen kcat/KM:n arvon lopullisen rajan asettaa k1, ES-kompleksin muodostumisnopeus. Tämä nopeus ei voi olla nopeampi kuin entsyymin ja sen substraatin diffuusio-ohjattu kohtaaminen. Diffuusio rajoittaa k1:n arvoa siten, että se ei voi olla suurempi kuin 108-109 s-1 M-1. Näin ollen kcat/KM:n yläraja on 108 ja 109 s-1 M-1 välillä.

Superoksididismutaasin, asetyylikoliiniesteraasin ja trioosifosfaatti-isomeraasin entsyymien kcat/KM-suhteet ovat 108 ja 109 s-1 M-1 välillä. Tällaiset entsyymit, joiden kcat/KM-suhteet ovat ylärajoilla, ovat saavuttaneet kineettisen täydellisyyden. Niiden katalyyttistä nopeutta rajoittaa vain nopeus, jolla ne kohtaavat substraatin liuoksessa (taulukko 8.8). Katalyyttistä nopeutta voidaan lisätä vain lyhentämällä diffuusioon kuluvaa aikaa. Muista, että aktiivinen alue on vain pieni osa entsyymin kokonaisrakenteesta. Katalyyttisesti täydellisissä entsyymeissä jokainen entsyymin ja substraatin kohtaaminen on kuitenkin tuottavaa. Tällöin entsyymissä voi olla vetovoimaisia sähköstaattisia voimia, jotka houkuttelevat substraatin aktiiviseen kohtaan. Näitä voimia kutsutaan joskus runollisesti Circe-ilmiöiksi.

Circe-ilmiö-

Vetovoimien hyödyntäminen substraatin houkuttelemiseksi paikkaan, jossa substraatti käy läpi rakennemuutoksen, kuten termin keksinyt entsymologi William P. Jencks on määritellyt.

Kreikkalaisen mytologian jumalatar Circe houkutteli Odysseuksen miehet taloonsa ja muutti heidät sitten sioiksi.

Taulukko 8.8

entsyymit, joiden kcat/KM on lähellä diffuusion ohjaamaa kohtaamisnopeutta.

Liuoksessa tapahtuvan diffuusionopeuden asettama rajoitus voidaan osittain ylittää myös rajaamalla substraatit ja tuotteet multientsyymikompleksin rajalliseen tilavuuteen. Jotkin entsyymisarjat ovatkin liittyneet järjestäytyneiksi kokonaisuuksiksi (luku 17.1.9) siten, että yhden entsyymin tuote on hyvin nopeasti seuraavan entsyymin löydettävissä. Itse asiassa tuotteet kanavoituvat entsyymiltä toiselle, aivan kuten liukuhihnassa.

8.4.3. Useimmat biokemialliset reaktiot sisältävät useita substraatteja

Useimmat biologisissa systeemeissä tapahtuvat reaktiot sisältävät yleensä kaksi substraattia ja kaksi tuotetta, ja niitä voidaan edustaa bisubstraattireaktiolla:

Vähemmistö tällaisista reaktioista sisältää funktionaalisen ryhmän, kuten fosforyyli- tai ammoniumryhmän, siirtämisen yhdestä substraatista toiseen. Hapetus-pelkistysreaktioissa elektronit siirtyvät substraattien välillä. Usean substraatin reaktiot voidaan jakaa kahteen luokkaan: sekventiaaliseen siirtymiseen ja kaksoissiirtymiseen.

Sekventiaalinen siirtyminen

Sekventiaalisessa mekanismissa kaikkien substraattien on sitouduttava entsyymiin ennen kuin mitään tuotetta vapautuu. Näin ollen bisubstraattireaktiossa muodostuu entsyymin ja molempien substraattien ternäärinen kompleksi. Sekventiaalisia mekanismeja on kahta tyyppiä: järjestettyjä, joissa substraatit sitoutuvat entsyymiin määrätyssä järjestyksessä, ja satunnaisia.

Monissa entsyymeissä, joiden substraattina on NAD+ tai NADH, esiintyy sekventiaalinen järjestetty mekanismi. Tarkastellaan laktaattidehydrogenaasia, joka on tärkeä entsyymi glukoosiaineenvaihdunnassa (luku 16.1.9). Tämä entsyymi pelkistää pyruvattia laktaatiksi samalla kun se hapettaa NADH:ta NAD+:ksi.

Sekventiaalisesti järjestetyssä mekanismissa koentsyymi sitoutuu aina ensin ja laktaatti vapautuu aina ensin. Tämä järjestys voidaan esittää W. Wallace Clelandin kehittämällä merkintätavalla seuraavasti:

Ensyymi on olemassa ternäärisenä kompleksina: ensin koostuen entsyymistä ja substraateista ja katalyysin jälkeen entsyymistä ja tuotteista.

Sattumanvaraisessa sekventiaalisessa mekanismissa substraattien lisäämisen ja tuotteiden vapauttamisen järjestys on satunnainen. Sekventiaalisia satunnaisreaktioita havainnollistaa kreatiinikinaasin katalysoima fosfokreatiinin ja ADP:n muodostuminen ATP:stä ja kreatiinista (luku 14.1.5).

Fosfokreatiini on tärkeä energianlähde lihaksessa. Peräkkäisiä satunnaisreaktioita voidaan kuvata myös Clelandin notaatiolla.

Vaikka tiettyjen tapahtumien järjestys on satunnainen, reaktio kulkee silti ternääristen kompleksien läpi sisältäen ensin substraatit ja sitten tuotteet.

Kaksoissiirtymä- eli ping-pong-reaktiot

Kaksoissiirtymä- eli ping-pong-reaktioissa yksi tai useampi tuote vapautuu ennen kuin kaikki substraatit sitoutuvat entsyymiin. Kaksoissiirtymäreaktioille on ominaista, että niissä esiintyy substituoitu entsyymiväliaine, jossa entsyymi on väliaikaisesti muuttunut. Reaktiot, joissa aminoryhmiä vaihdetaan aminohappojen ja α-ketohappojen välillä, ovat klassisia esimerkkejä kaksoissiirtymismekanismeista. Aspartaattiaminotransferaasientsyymi (luku 23.3.1) katalysoi aminoryhmän siirtoa aspartaatista α-ketoglutaraattiin.

Tapahtumien kulku voidaan esittää seuraavassa kaaviossa.

Kun aspartaatti on sitoutunut entsyymiin, entsyymi irrottaa aspartaatin aminoryhmän muodostaen substituoidun entsyymiväliaineen. Ensimmäinen tuote, oksaloasetaatti, poistuu tämän jälkeen. Toinen substraatti, α-ketoglutaraatti, sitoutuu entsyymiin, ottaa aminoryhmän muunnetusta entsyymistä ja vapautuu sitten lopputuotteena, glutamaattina. Clelandin notaatiossa substraatit näyttävät pomppivan entsyymin päälle ja pois analogisesti pöydällä pomppivan pingispallon kanssa.

8.4.4. Allosteriset entsyymit eivät tottele Michaelis-Mentenin kinetiikkaa

Michaelis-Mentenin malli on auttanut suuresti entsyymikemian kehitystä. Sen hyviä puolia ovat yksinkertaisuus ja laaja sovellettavuus. Michaelis-Mentenin malli ei kuitenkaan pysty selittämään monien entsyymien kineettisiä ominaisuuksia. Tärkeä ryhmä entsyymejä, jotka eivät noudata Michaelis-Mentenin kinetiikkaa, ovat allosteriset entsyymit. Nämä entsyymit koostuvat useista alayksiköistä ja useista aktiivisista alueista.

Allosterisissa entsyymeissä reaktionopeuden V0 ja substraattikonsentraation välinen kuvaaja on usein sigmoidinen (kuva 8.14) eikä Michaelis-Mentenin yhtälön (yhtälö 23) ennustama hyperbolinen kuvaaja. Allosterisissa entsyymeissä substraatin sitoutuminen yhteen aktiiviseen kohtaan voi vaikuttaa saman entsyymimolekyylin muiden aktiivisten paikkojen ominaisuuksiin. Tämän alayksiköiden välisen vuorovaikutuksen mahdollinen tulos on, että substraatin sitoutuminen muuttuu yhteistoiminnalliseksi; toisin sanoen substraatin sitoutuminen entsyymin yhteen aktiiviseen kohtaan helpottaa substraatin sitoutumista muihin aktiivisiin kohtiin. Kuten luvussa 10 tarkastellaan, tällainen yhteistoiminnallisuus johtaa V0:n ja . Lisäksi allosteerisen entsyymin aktiivisuutta voivat muuttaa säätelymolekyylit, jotka ovat palautuvasti sitoutuneet tiettyihin muihin kuin katalyyttisiin alueisiin. Allosteristen entsyymien katalyyttisiä ominaisuuksia voidaan siten säätää solun välittömien tarpeiden mukaan (luku 10). Tästä syystä allosteriset entsyymit ovat solun aineenvaihduntareittien keskeisiä säätelijöitä.

Kuva 8.14

Allosterisen entsyymin kinetiikka. Allosterisissa entsyymeissä reaktionopeuden riippuvuus substraattikonsentraatiosta on sigmoidinen.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.