A função primária das enzimas é aumentar as taxas de reacções de modo a que sejam compatíveis com as necessidades do organismo. Para compreender como as enzimas funcionam, precisamos de uma descrição cinética da sua actividade. Para muitas enzimas, a taxa de catálise V0, que é definida como o número de toupeiras de produto formadas por segundo, varia de acordo com a concentração do substrato, da forma mostrada na Figura 8.11. A taxa de catálise aumenta linearmente à medida que a concentração do substrato aumenta e então começa a se nivelar e se aproximar do máximo em concentrações mais elevadas do substrato. Antes de podermos interpretar este gráfico com precisão, precisamos entender como ele é gerado. Considere uma enzima que catalise o S a P pelo seguinte caminho:
- Figure 8.11
- Figure 8.12
- Figure 8.13
- 8.4.1. A significância dos valores de KM e Vmax
- Conceptual Insights, Steady-State Enzyme Kinetics
- Tabela 8.5
- Tabela 8.6
- 8.4.2. Perfeição Cinética na Catálise Enzimática: O critério kcat/KM
- Tabela 8.7
- Efeito Circe-
- Quadro 8.8
- 8.4.3. A maioria das Reações Bioquímicas inclui múltiplos substratos
- Deslocamento sequencial
- Reações de Duplo Deslocamento (Ping-Pong)
- 8.4.4. Enzimas Allostéricas Não Obedecem à Cinética Quaresmal de Michaelis
- Figure 8.14
Figure 8.11
Michaelis-Menten Kinetics. Um gráfico da velocidade de reacção (V0) em função da concentração do substrato de uma enzima que obedece à Cinética Quaresmal de Michaelis mostra que a velocidade máxima (Vmax) é aproximada assimptticamente. A constante de Michaelis (mais…)
A extensão da formação do produto é determinada como uma função do tempo para uma série de concentrações do substrato (Figura 8.12). Como esperado, em cada caso, a quantidade de produto formado aumenta com o tempo, embora eventualmente um tempo seja alcançado quando não há alteração líquida na concentração de S ou P. A enzima ainda está convertendo ativamente o substrato em produto e vice-versa, mas o equilíbrio da reação foi alcançado. A Figura 8.13A ilustra as mudanças na concentração observadas em todos os participantes da reação com o tempo até que o equilíbrio seja alcançado.
Figure 8.12
Determinando a Velocidade Inicial. A quantidade de produto formada em diferentes concentrações de substrato é plotada em função do tempo. A velocidade inicial (V0) para cada concentração de substrato é determinada a partir da inclinação da curva no início de (mais…)
Figure 8.13
Alterações na Concentração de Reacção Participantes de uma Reacção Catalizada por uma Enzima com o Tempo. A concentração muda sob (A) condições de estado estável, e (B) condições de estado pré-estabilizado.
A cinética enzimática é mais facilmente abordada se pudermos ignorar a reacção de retorno. Definimos V0 como a taxa de aumento do produto com o tempo quando está baixo; ou seja, em momentos próximos a zero (daí, V0) (Figura 8.13B). Assim, para o gráfico da Figura 8.11, V0 é determinado para cada concentração de substrato medindo a taxa de formação do produto nos momentos iniciais antes do P se acumular (ver Figura 8.12).
Iniciamos nosso exame cinético da atividade enzimática com o gráfico mostrado na Figura 8.11. A uma concentração fixa de enzima, V0 é quase linearmente proporcional a quando é pequeno mas é quase independente de quando é grande. Em 1913, Leonor Michaelis e Maud Menten propuseram um modelo simples para dar conta destas características cinéticas. A característica crítica no seu tratamento é que um complexo específico de ES é um intermediário necessário na catálise. O modelo proposto, que é o mais simples que explica as propriedades cinéticas de muitas enzimas, é
Uma enzima E combina com o substrato S para formar um complexo ES, com uma constante de taxa k1. O complexo ES tem dois possíveis destinos. Pode dissociar-se de E e S, com uma constante de taxa k-1, ou pode proceder para formar o produto P, com uma constante de taxa k2. Novamente, assumimos que quase nenhum produto reverte para o substrato inicial, condição que se mantém no estágio inicial de uma reação antes da concentração do produto ser apreciável.
Queremos uma expressão que relacione a taxa de catálise com as concentrações de substrato e enzima e as taxas das etapas individuais. O nosso ponto de partida é que a taxa catalítica é igual ao produto da concentração do complexo ES e k2,
Agora precisamos de expressar em termos de quantidades conhecidas. As taxas de formação e decomposição do ES são dadas por:
Para simplificar, vamos trabalhar sob a hipótese de estado estacionário. Em estado estacionário, as concentrações de intermediários, neste caso, permanecem as mesmas, mesmo que as concentrações de matérias-primas e produtos estejam mudando. Isto ocorre quando as taxas de formação e de decomposição do complexo ES são iguais. Ajustando os lados direitos das equações 11 e 12 iguais, obtém-se
>Por meio da equação 13, obtém-se
Equação 14 pode ser simplificada definindo-se uma nova constante, KM, chamada constante de Michaelis:
Nota que KM tem as unidades de concentração. KM é uma característica importante das interações enzima-substrato e é independente das concentrações de enzimas e substratos.
Inserir a equação 15 na equação 14 e resolver para rendimentos
Agora vamos examinar o numerador da equação 16. A concentração do substrato não combinado é muito próxima da concentração total do substrato, desde que a concentração da enzima seja muito mais baixa do que a do substrato. A concentração de enzima não combinada é igual à concentração total da enzima T menos a concentração do complexo ES.
Substituindo esta expressão por na equação 16 dá
>Equação de resolução 18 por dá
>ou
Substituindo esta expressão por na equação 10, obtemos
A taxa máxima, Vmax, é atingida quando os locais catalíticos da enzima estão saturados com substrato – isto é, quando = T. Assim,
>Substituindo a equação 22 na equação 21 produz a equação de Michaelis-Menten:
Esta equação contabiliza os dados cinéticos apresentados na Figura 8.11. Com muito baixa concentração do substrato, quando é muito menor que KM, V0 = (Vmax/KM); ou seja, a taxa é diretamente proporcional à concentração do substrato. Em concentração muito alta do substrato, quando é muito maior que KM, V0 = Vmax; ou seja, a taxa é máxima, independente da concentração do substrato.
O significado de KM é evidente a partir da equação 23. Quando = KM, então V0 = Vmax/2. Assim, KM é igual à concentração do substrato na qual a taxa de reacção é metade do seu valor máximo. KM é uma característica importante de uma reação catalisada por enzimas e é significativa para sua função biológica.
A conseqüência fisiológica de KM é ilustrada pela sensibilidade de alguns indivíduos ao etanol. Tais pessoas apresentam rubor facial e freqüência cardíaca rápida (taquicardia) após ingerirem mesmo pequenas quantidades de álcool. No fígado, a álcool desidrogenase converte etanol em acetaldeído.
Normalmente, o acetaldeído, que é a causa dos sintomas quando presente em altas concentrações, é processado para acetato por acetaldeído desidrogenase.
A maioria das pessoas tem duas formas de acetaldeído desidrogenase, uma forma mitocondrial KM baixa e uma forma citosólica KM alta. Em pessoas suscetíveis, a enzima mitocondrial é menos ativa devido à substituição de um único aminoácido, e o acetaldeído é processado apenas pela enzima citosólica. Como esta enzima tem um KM elevado, menos acetaldeído é convertido em acetato; o excesso de acetaldeído escapa para o sangue e é responsável pelos efeitos fisiológicos.
8.4.1. A significância dos valores de KM e Vmax
Conceptual Insights, Steady-State Enzyme Kinetics
Aprenda como os parâmetros cinéticos KM e Vmaxcan podem ser determinados experimentalmente usando a simulação do laboratório de cinética enzimática neste módulo de mídia.
A constante de Michaelis, KM, e a taxa máxima, Vmax, podem ser prontamente derivadas de taxas de catálise medidas em uma variedade de concentrações de substrato se uma enzima operar de acordo com o esquema simples dado na equação 23. A derivação de KM e Vmax é mais comumente obtida com o uso de programas de ajuste de curvas em um computador (veja o apêndice deste capítulo para meios alternativos de determinação de KM e Vmax). Os valores de KM das enzimas variam amplamente (Tabela 8.5). Para a maioria das enzimas, o KM situa-se entre 10-1 e 10-7 M. O valor KM de uma enzima depende do substrato particular e das condições ambientais, tais como pH, temperatura e força iónica. A constante de Michaelis, KM, tem dois significados. Primeiro, KM é a concentração do substrato em que metade dos locais activos são preenchidos. Assim, KM fornece uma medida da concentração do substrato necessária para que ocorra uma catálise significativa. Na verdade, para muitas enzimas, evidências experimentais sugerem que o KM fornece uma aproximação da concentração do substrato in vivo. Quando o KM é conhecido, a fração de locais preenchidos, fES, em qualquer concentração do substrato pode ser calculada a partir de
Tabela 8.5
Valores de KM de algumas enzimas.
Segundo, KM está relacionado com as constantes de taxa dos passos individuais no esquema catalítico dado na equação 9. Na equação 15, KM é definido como (k-1 + k2)/k1. Considere um caso limite no qual k-1 é muito maior que k2. Sob tais circunstâncias, o complexo ES dissocia-se de E e S muito mais rapidamente do que o produto é formado. Sob essas condições (k-1 >> k2),
A constante de dissociação do complexo ES é dada por
>Em outras palavras, KM é igual à constante de dissociação do complexo ES se k2 é muito menor que k-1. Quando esta condição é satisfeita, KM é uma medida da força do complexo ES: um KM alto indica ligação fraca; um KM baixo indica ligação forte. Deve-se salientar que KM indica a afinidade do complexo ES apenas quando k-1 é muito maior que k2.
A taxa máxima, Vmax, revela o número de rotação de uma enzima, que é o número de moléculas de substrato convertidas em produto por uma molécula enzimática num tempo unitário quando a enzima está totalmente saturada com substrato. É igual à constante cinética k2, que também é chamada kcat. A taxa máxima, Vmax, revela o número de rotação de uma enzima se a concentração de sítios ativos T for conhecida, porque
e assim
Por exemplo, uma solução de 10-6 M de anidrase carbônica catalisa a formação de 0,6 M H2CO3 por segundo quando está totalmente saturada com o substrato. Portanto, k2 é 6 × 105 s-1. Este número de volume de negócios é um dos maiores conhecidos. Cada reacção catalisada tem lugar num tempo igual a 1/k2, que é 1,7 μs para a anidrase carbónica. Os números de turnover da maioria das enzimas com seus substratos fisiológicos caem na faixa de 1 a 104 por segundo (Tabela 8.6).
Tabela 8.6
Números máximos de turnover de algumas enzimas.
8.4.2. Perfeição Cinética na Catálise Enzimática: O critério kcat/KM
Quando a concentração do substrato é muito maior que KM, a taxa de catálise é igual a kcat, o número de turnover, como descrito na Seção 8.4.1. Entretanto, a maioria das enzimas não está normalmente saturada com o substrato. Sob condições fisiológicas, a razão /KM está tipicamente entre 0,01 e 1,0. Quando << KM, a taxa enzimática é muito menor que kcat porque a maioria dos locais ativos estão desocupados. Existe um número que caracteriza a cinética de uma enzima sob estas condições celulares mais típicas? De fato existe, como pode ser demonstrado pela combinação das equações 10 e 16 para dar
Quando << KM, a concentração da enzima livre, , é quase igual à concentração total da enzima , então
Assim, quando << KM, a velocidade enzimática depende dos valores de kcat/KM, , e T. Sob estas condições, kcat/KM é a constante de taxa para a interação de S e E e pode ser usada como medida de eficiência catalítica. Por exemplo, usando valores de kcat/KM, pode-se comparar a preferência de uma enzima por diferentes substratos. A Tabela 8.7 mostra os valores de kcat/KM para vários substratos diferentes de quimotripsina (Secção 9.1.1). A quimotripsina tem claramente uma preferência por clivagem ao lado de cadeias laterais volumosas e hidrofóbicas.
Tabela 8.7
Preferências de substrato de quimotripsina.
Quão eficiente pode ser uma enzima? Podemos abordar esta questão determinando se existem limites físicos para o valor do kcat/KM. Note que esta relação depende de k1, k-1 e kcat, como pode ser demonstrado pela substituição de KM.
>Suponha que a taxa de formação do produto (kcat) é muito mais rápida que a taxa de dissociação do complexo ES (k-1). O valor de kcat/KM aproxima-se então de k1. Assim, o limite final do valor de kcat/KM é definido por k1, a taxa de formação do complexo ES. Esta taxa não pode ser mais rápida do que o encontro controlado por difusão de uma enzima e seu substrato. A difusão limita o valor de k1 para que não possa ser superior a entre 108 e 109 s-1 M-1. Assim, o limite superior de kcat/KM está entre 108 e 109 s-1 M-1.
As razões kcat/KM das enzimas superóxido dismutase, acetilcolinesterase, e triose fosfato isomerase estão entre 108 e 109 s-1 M-1. Enzimas como estas que têm a razão kcat/KM nos limites superiores atingiram a perfeição cinética. A sua velocidade catalítica é restringida apenas pela taxa a que encontram substrato na solução (Tabela 8.8). Qualquer ganho adicional na taxa catalítica só pode vir diminuindo o tempo de difusão. Lembre-se que o local ativo é apenas uma pequena parte da estrutura enzimática total. Contudo, para enzimas catalíticas perfeitas, cada encontro entre a enzima e o substrato é produtivo. Nestes casos, pode haver forças electrostáticas atractivas sobre a enzima que atraem o substrato para o local activo. Essas forças são às vezes referidas poeticamente como efeitos Circe.
Efeito Circe-
A utilização de forças atrativas para atrair um substrato para um local no qual ele sofre uma transformação de estrutura, como definido por William P. Jencks, um enzimologista, que cunhou o termo.
Uma deusa da mitologia grega, Circe atraiu os homens de Odisseu para sua casa e depois os transformou em porcos.
Quadro 8.8
Enzimas para as quais o kcat/KM está próximo da taxa de encontro controlada pela difusão.
O limite imposto pela taxa de difusão em solução também pode ser parcialmente ultrapassado confinando substratos e produtos no volume limitado de um complexo multienzimático. De facto, algumas séries de enzimas estão associadas em conjuntos organizados (Secção 17.1.9) para que o produto de uma enzima seja muito rapidamente encontrado pela enzima seguinte. Na verdade, os produtos são canalizados de uma enzima para a próxima, como numa linha de montagem.
8.4.3. A maioria das Reações Bioquímicas inclui múltiplos substratos
A maioria das reações em sistemas biológicos geralmente inclui dois substratos e dois produtos e pode ser representada pela reação de bissubstrato:
>A maioria dessas reações implica a transferência de um grupo funcional, como um grupo fosforilo ou amônio, de um substrato para o outro. Nas reacções de oxidação-redução, os electrões são transferidos entre os substratos. Reações de múltiplos substratos podem ser divididas em duas classes: deslocamento sequencial e deslocamento duplo.
Deslocamento sequencial
No mecanismo sequencial, todos os substratos devem se ligar à enzima antes que qualquer produto seja liberado. Consequentemente, em uma reação de bissubstrato, forma-se um complexo ternário da enzima e ambos os substratos. Os mecanismos sequenciais são de dois tipos: ordenados, nos quais os substratos ligam a enzima numa sequência definida, e aleatórios.
Muitas enzimas que têm NAD+ ou NADH como substrato exibem o mecanismo sequencial ordenado. Considere a desidrogenase láctica, uma enzima importante no metabolismo da glucose (Secção 16.1.9). Esta enzima reduz o piruvato ao lactato enquanto oxida o NADH ao NAD+.
No mecanismo sequencial ordenado, a coenzima liga-se sempre primeiro e o lactato é sempre libertado primeiro. Esta sequência pode ser representada da seguinte forma numa notação desenvolvida por W. Wallace Cleland:
A enzima existe como um complexo ternário: primeiro, consiste na enzima e nos substratos e, após a catálise, na enzima e nos produtos.
No mecanismo sequencial ordenado, a ordem de adição dos substratos e de libertação dos produtos é aleatória. Reações seqüenciais aleatórias são ilustradas pela formação de fosfocreatina e ADP a partir de ATP e creatina, uma reação catalisada pela creatina cinase (Seção 14.1.5).
Fosfocreatina é uma importante fonte de energia no músculo. Reações seqüenciais aleatórias também podem ser retratadas na notação Cleland.
Embora a ordem de certos eventos seja aleatória, a reação ainda passa através dos complexos ternários incluindo, primeiro, substratos e, em seguida, produtos.
Reações de Duplo Deslocamento (Ping-Pong)
Em reações de Duplo Deslocamento, ou Ping-Pong, um ou mais produtos são liberados antes que todos os substratos liguem a enzima. A característica que define as reacções de dupla substituição é a existência de um intermediário enzimático substituído, no qual a enzima é temporariamente modificada. Reações que grupos de aminoácidos entre aminoácidos e os ácidos α-keto são exemplos clássicos de mecanismos de deslocamento duplo. A enzima aspartato aminotransferase (Secção 23.3.1) catalisa a transferência de um grupo de aminoácidos do aspartato para α-ketoglutarate.
>A sequência de eventos pode ser retratada como o seguinte diagrama.
Após o aspartato se ligar à enzima, a enzima remove o grupo de aminoácidos do aspartato para formar a enzima intermediária substituída. O primeiro produto, o oxaloacetato, parte posteriormente. O segundo substrato, α-ketoglutarate, liga-se à enzima, aceita o grupo amino da enzima modificada e é então liberado como produto final, o glutamato. Na notação Cleland, os substratos parecem saltar para dentro e para fora da enzima de forma análoga a uma bola de Ping-Pong que salta sobre uma mesa.
8.4.4. Enzimas Allostéricas Não Obedecem à Cinética Quaresmal de Michaelis
O modelo quaresmal de Michaelis tem ajudado muito no desenvolvimento da química enzimática. Suas virtudes são a simplicidade e a ampla aplicabilidade. Contudo, o modelo de Quaresma de Michaelis não pode explicar as propriedades cinéticas de muitas enzimas. Um importante grupo de enzimas que não obedecem à cinética de Michaelis-Menten compreende as enzimas alostóricas. Estas enzimas consistem de múltiplas subunidades e múltiplos locais ativos.
As enzimas alostóricas freqüentemente apresentam gráficos sigmoidais (Figura 8.14) da velocidade de reação V0 versus concentração do substrato , ao invés dos gráficos hiperbólicos previstos pela equação de Michaelis-Menten (equação 23). Nas enzimas alostóricas, a ligação do substrato a um local activo pode afectar as propriedades de outros locais activos na mesma molécula enzimática. Um possível resultado desta interação entre subunidades é que a ligação do substrato torna-se cooperativa; isto é, a ligação do substrato a um local ativo da enzima facilita a ligação do substrato aos outros locais ativos. Como será considerado no Capítulo 10, tal cooperativismo resulta em uma trama sigmoidal de V0 versus . Além disso, a actividade de uma enzima alostórica pode ser alterada por moléculas reguladoras que estão reversivelmente ligadas a sítios específicos que não os sítios catalíticos. As propriedades catalíticas das enzimas alérgicas podem assim ser ajustadas para satisfazer as necessidades imediatas de uma célula (Capítulo 10). Por esta razão, as enzimas alérgicas são reguladores chave das vias metabólicas na célula.
Figure 8.14
Kinetics for an Allosteric Enzyme. As enzimas alérgicas apresentam uma dependência sigmoidal da velocidade de reacção em relação à concentração do substrato.