Bookshelf

8.4.1. Acetaldehyd v mitofilní formě Význam hodnot KM a Vmax

Michaelisovu konstantu, KM, a maximální rychlost, Vmax, lze snadno odvodit z rychlostí katalýzy naměřených při různých koncentracích substrátu, pokud enzym pracuje podle jednoduchého schématu uvedeného v rovnici č. 23. Odvození KM a Vmax se nejčastěji provádí pomocí programů pro fitování křivek na počítači (alternativní způsoby stanovení KM a Vmax jsou uvedeny v příloze této kapitoly). Hodnoty KM enzymů se pohybují v širokém rozmezí (tabulka 8.5). U většiny enzymů se KM pohybuje mezi 10-1 a 10-7 M. Hodnota KM pro enzym závisí na konkrétním substrátu a na podmínkách prostředí, jako je pH, teplota a iontová síla. Michaelisova konstanta KM má dva významy. Za prvé, KM je koncentrace substrátu, při které je zaplněna polovina aktivních míst. KM tedy udává míru koncentrace substrátu potřebnou k tomu, aby došlo k významné katalýze. U mnoha enzymů experimentální důkazy naznačují, že KM poskytuje přibližnou hodnotu koncentrace substrátu in vivo. Je-li KM známa, lze podíl zaplněných míst, fES, při jakékoli koncentraci substrátu vypočítat z

Tabulka 8.5

Hodnoty KM některých enzymů.

Druhé, KM souvisí s rychlostními konstantami jednotlivých kroků v katalytickém schématu, které jsou uvedeny v rovnici 9. V rovnici 15 je KM definována jako (k-1 + k2)/k1. Uvažujme limitní případ, ve kterém je k-1 mnohem větší než k2. Za takových okolností komplex ES disociuje na E a S mnohem rychleji, než se tvoří produkt. Za těchto podmínek (k-1 >> k2),

Disociační konstanta komplexu ES je dána vztahem

Jinými slovy, KMje rovna disociační konstantě komplexu ES, jestliže k2 je mnohem menší než k-1. Je-li tato podmínka splněna, je KM mírou síly ES komplexu: vysoká KM znamená slabou vazbu; nízká KM znamená silnou vazbu. Je třeba zdůraznit, že KM udává afinitu ES komplexu pouze tehdy, když je k-1 mnohem větší než k2.

Maximální rychlost, Vmax, prozrazuje číslo obratu enzymu, což je počet molekul substrátu přeměněných na produkt molekulou enzymu za jednotku času, když je enzym plně nasycen substrátem. Je rovno kinetické konstantě k2, která se také nazývá kcat. Maximální rychlost, Vmax, prozrazuje číslo obratu enzymu, je-li známa koncentrace aktivních míst T, protože

a tedy

Například 10-6 M roztok uhličité anhydrázy katalyzuje tvorbu 0,6 M H2CO3 za sekundu, když je plně nasycen substrátem. Proto je k2 6 × 105 s-1. Toto číslo obratu je jedno z největších známých. Každá katalyzovaná reakce proběhne za dobu rovnou 1/k2, což je u karbonanhydrázy 1,7 μs. Čísla obratu většiny enzymů s jejich fyziologickými substráty spadají do rozmezí 1 až 104 za sekundu (tabulka 8.6).

Tabulka 8.6

Maximální čísla obratu některých enzymů.

8.4.2. Kinetická dokonalost v enzymové katalýze: Kritérium kcat/KM

Když je koncentrace substrátu mnohem vyšší než KM, je rychlost katalýzy rovna kcat, číslu obratu, jak je popsáno v části 8.4.1. Většina enzymů však za normálních okolností není nasycena substrátem. Za fyziologických podmínek je poměr /KM obvykle mezi 0,01 a 1,0. Když << KM, je enzymová rychlost mnohem nižší než kcat, protože většina aktivních míst je neobsazena. Existuje číslo, které charakterizuje kinetiku enzymu za těchto typičtějších buněčných podmínek? Skutečně existuje, jak lze ukázat kombinací rovnic 10 a 16 a získat

Když << KM, koncentrace volného enzymu , je téměř rovna celkové koncentraci enzymu , takže

Když << KM, enzymatická rychlost závisí na hodnotách kcat/KM, , a T. Za těchto podmínek je kcat/KM rychlostní konstantou pro interakci S a E a lze ji použít jako míru katalytické účinnosti. Pomocí hodnot kcat/KM lze například porovnat preferenci enzymu pro různé substráty. Tabulka 8.7 uvádí hodnoty kcat/KM pro několik různých substrátů chymotrypsinu (oddíl 9.1.1). Chymotrypsin zjevně preferuje štěpení vedle objemných hydrofobních postranních řetězců.

Tabulka 8.7

Substrátové preference chymotrypsinu.

Jak účinný může enzym být? K této otázce můžeme přistoupit tak, že zjistíme, zda existují nějaké fyzikální limity pro hodnotu kcat/KM. Všimněte si, že tento poměr závisí na k1, k-1 a kcat, jak lze ukázat substitucí KM.

Předpokládejme, že rychlost tvorby produktu (kcat) je mnohem rychlejší než rychlost disociace komplexu ES (k-1). Hodnota kcat/KM se pak blíží k1. Konečná hranice hodnoty kcat/KM je tedy dána k1, rychlostí tvorby komplexu ES. Tato rychlost nemůže být rychlejší než difuzí řízené setkání enzymu a jeho substrátu. Difuze omezuje hodnotu k1 tak, že nemůže být vyšší než 108 až 109 s-1 M-1. Proto je horní hranice kcat/KM mezi 108 a 109 s-1 M-1.

Poměry kcat/KM enzymů superoxiddismutasy, acetylcholinesterasy a triosefosfátisomerasy jsou mezi 108 a 109 s-1 M-1. Takové enzymy, které mají poměry kcat/KM na horní hranici, dosáhly kinetické dokonalosti. Jejich katalytická rychlost je omezena pouze rychlostí, kterou se setkávají se substrátem v roztoku (tabulka 8.8). Další zvýšení katalytické rychlosti může nastat pouze zkrácením doby difuze. Nezapomeňte, že aktivní místo je pouze malou částí celkové struktury enzymu. Přesto je u katalyticky dokonalých enzymů každé setkání enzymu se substrátem produktivní. V těchto případech mohou na enzym působit přitažlivé elektrostatické síly, které lákají substrát do aktivního místa. Tyto síly se někdy poeticky označují jako Circeův efekt.

Tabulka 8.8

Enzymy, pro které se kcat/KM blíží rychlosti setkání řízené difuzí.

Omezení dané rychlostí difuze v roztoku lze také částečně překonat uzavřením substrátů a produktů v omezeném objemu multienzymového komplexu. Některé řady enzymů jsou totiž sdruženy do organizovaných sestav (oddíl 17.1.9), takže produkt jednoho enzymu je velmi rychle nalezen dalším enzymem. V podstatě jsou produkty směrovány od jednoho enzymu k dalšímu, podobně jako na montážní lince.

8.4.3. Způsob, jakým jsou produkty směrovány od jednoho enzymu k druhému. Většina biochemických reakcí zahrnuje více substrátů

Většina reakcí v biologických systémech obvykle zahrnuje dva substráty a dva produkty a může být reprezentována bisubstrátovou reakcí:

Většina takových reakcí zahrnuje přenos funkční skupiny, například fosforylové nebo amonné skupiny, z jednoho substrátu na druhý. Při oxidačně-redukčních reakcích dochází k přenosu elektronů mezi substráty. Reakce s více substráty lze rozdělit do dvou tříd: sekvenční přemístění a dvojité přemístění.

Sekvenční přemístění

V sekvenčním mechanismu se musí všechny substráty navázat na enzym, než se uvolní jakýkoli produkt. V důsledku toho vzniká při bisubstrátové reakci ternární komplex enzymu a obou substrátů. Sekvenční mechanismy jsou dvojího typu: uspořádané, při nichž se substráty vážou na enzym v definovaném pořadí, a náhodné.

Mnoho enzymů, které mají jako substrát NAD+ nebo NADH, vykazuje uspořádaný sekvenční mechanismus. Vezměme si laktátdehydrogenázu, důležitý enzym v metabolismu glukózy (oddíl 16.1.9). Tento enzym redukuje pyruvát na laktát a zároveň oxiduje NADH na NAD+.

V uspořádaném sekvenčním mechanismu se koenzym vždy váže jako první a laktát se vždy uvolňuje jako první. Tuto posloupnost lze znázornit následujícím zápisem, který vypracoval W. Wallace Cleland:

Enzym existuje jako ternární komplex: nejprve se skládá z enzymu a substrátů a po katalýze z enzymu a produktů.

V náhodném sekvenčním mechanismu je pořadí přidávání substrátů a uvolňování produktů náhodné. Sekvenční náhodné reakce ilustruje tvorba fosfokreatinu a ADP z ATP a kreatinu, reakce katalyzovaná kreatinkinázou (oddíl 14.1.5).

Fosfokreatin je důležitým zdrojem energie ve svalech. Náhodné sekvenční reakce lze také znázornit v Clelandově zápisu.

Přestože je pořadí některých událostí náhodné, reakce stále probíhá přes ternární komplexy zahrnující nejprve substráty a poté produkty.

Reakce s dvojím přemístěním (ping-pongové reakce)

Při reakcích s dvojím přemístěním neboli ping-pongových reakcích se jeden nebo více produktů uvolní dříve, než se na enzym navážou všechny substráty. Charakteristickým rysem reakcí s dvojím vytěsněním je existence substituovaného enzymového meziproduktu, v němž je enzym dočasně modifikován. Reakce, při nichž dochází k přesunu aminoskupin mezi aminokyselinami a α-ketokyselinami, jsou klasickými příklady mechanismů dvojího vytěsnění. Enzym aspartátaminotransferáza (oddíl 23.3.1) katalyzuje přenos aminoskupiny z aspartátu na α-ketoglutarát.

Sekvenci událostí lze znázornit následujícím schématem.

Po navázání aspartátu na enzym enzym enzym odstraní aminoskupinu aspartátu za vzniku substituovaného meziproduktu enzymu. Následně odchází první produkt, oxaloacetát. Druhý substrát, α-ketoglutarát, se váže na enzym, přijímá aminoskupinu z modifikovaného enzymu a poté se uvolňuje jako konečný produkt, glutamát. V Clelandově zápisu se zdá, že substráty se odrážejí od enzymu analogicky k pingpongovému míčku poskakujícímu po stole.

8.4.4. Substráty se odrážejí od enzymu. Alosterické enzymy se nepodřizují Michaelisově-Mentenově kinetice

Michaelisův-Mentenův model výrazně napomohl rozvoji enzymové chemie. Jeho předností je jednoduchost a široká použitelnost. Michaelis-Mentenův model však nedokáže vysvětlit kinetické vlastnosti mnoha enzymů. Důležitou skupinu enzymů, které se neřídí Michaelis-Mentenovou kinetikou, tvoří alosterické enzymy. Tyto enzymy se skládají z více podjednotek a více aktivních míst.

Allosterické enzymy často vykazují sigmoidní grafy (obrázek 8.14) reakční rychlosti V0 v závislosti na koncentraci substrátu , nikoli hyperbolické grafy předpovězené Michaelis-Mentenovou rovnicí (rovnice 23). U alosterických enzymů může vazba substrátu na jedno aktivní místo ovlivnit vlastnosti ostatních aktivních míst v téže molekule enzymu. Možným výsledkem této interakce mezi podjednotkami je, že vazba substrátu se stává kooperativní; to znamená, že vazba substrátu na jedno aktivní místo enzymu usnadňuje vazbu substrátu na ostatní aktivní místa. Jak bude uvedeno v kapitole 10, výsledkem takové kooperativity je sigmoidální graf závislosti V0 na . Kromě toho může být aktivita alosterického enzymu změněna regulačními molekulami, které jsou reverzibilně vázány na jiná než katalytická místa. Katalytické vlastnosti alosterických enzymů tak mohou být upraveny tak, aby vyhovovaly okamžitým potřebám buňky (kapitola 10). Z tohoto důvodu jsou alosterické enzymy klíčovými regulátory metabolických drah v buňce.

Obrázek 8.14

Kinetika pro alosterický enzym. Alosterické enzymy vykazují sigmoidální závislost reakční rychlosti na koncentraci substrátu.