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Die Hauptfunktion von Enzymen besteht darin, die Reaktionsgeschwindigkeit so zu erhöhen, dass sie mit den Bedürfnissen des Organismus vereinbar ist. Um zu verstehen, wie Enzyme funktionieren, brauchen wir eine kinetische Beschreibung ihrer Aktivität. Bei vielen Enzymen variiert die Katalyserate V0, die als die Anzahl der pro Sekunde gebildeten Produktmole definiert ist, mit der Substratkonzentration, wie in Abbildung 8.11 dargestellt. Die Katalyserate steigt linear mit zunehmender Substratkonzentration an und beginnt dann abzuflachen und nähert sich bei höheren Substratkonzentrationen einem Maximum. Bevor wir dieses Diagramm genau interpretieren können, müssen wir verstehen, wie es zustande kommt. Betrachten wir ein Enzym, das die Umwandlung von S in P über den folgenden Weg katalysiert:

Das Ausmaß der Produktbildung wird in Abhängigkeit von der Zeit für eine Reihe von Substratkonzentrationen bestimmt (Abbildung 8.12). Wie erwartet, nimmt die Menge des gebildeten Produkts in jedem Fall mit der Zeit zu, obwohl schließlich ein Zeitpunkt erreicht wird, an dem sich die Konzentration von S oder P nicht mehr ändert. Das Enzym wandelt immer noch aktiv Substrat in Produkt um und umgekehrt, aber das Reaktionsgleichgewicht ist erreicht. Abbildung 8.13A zeigt die Konzentrationsänderungen, die bei allen Reaktionsteilnehmern mit der Zeit beobachtet werden, bis das Gleichgewicht erreicht ist.

Abbildung 8.12

Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit. Die Menge des gebildeten Produkts bei verschiedenen Substratkonzentrationen ist als Funktion der Zeit aufgetragen. Die Anfangsgeschwindigkeit (V0) für jede Substratkonzentration wird aus der Steigung der Kurve zu Beginn der (mehr…)

Abbildung 8.13

Veränderungen der Konzentration der Reaktionsteilnehmer einer enzymkatalysierten Reaktion mit der Zeit. Konzentrationsänderungen unter (A) Steady-State-Bedingungen und (B) Pre-State-Bedingungen.

Die Enzymkinetik ist leichter zu verstehen, wenn wir die Rückreaktion ignorieren können. Wir definieren V0 als die Rate der Produktzunahme mit der Zeit, wenn sie niedrig ist, d. h. zu Zeiten nahe Null (daher V0) (Abbildung 8.13B). Für das Diagramm in Abbildung 8.11 wird V0 also für jede Substratkonzentration bestimmt, indem die Produktbildungsrate zu frühen Zeitpunkten vor der Akkumulation von P gemessen wird (siehe Abbildung 8.12).

Wir beginnen unsere kinetische Untersuchung der Enzymaktivität mit dem in Abbildung 8.11 gezeigten Diagramm. Bei einer festen Enzymkonzentration ist V0 fast linear proportional zu wenn ist klein, aber fast unabhängig von wenn ist groß. Im Jahr 1913 schlugen Leonor Michaelis und Maud Menten ein einfaches Modell vor, um diese kinetischen Eigenschaften zu erklären. Das entscheidende Merkmal in ihrem Ansatz ist, dass ein spezifischer ES-Komplex ein notwendiges Zwischenprodukt in der Katalyse ist. Das vorgeschlagene Modell ist das einfachste Modell, das die kinetischen Eigenschaften vieler Enzyme erklärt:

Ein Enzym E verbindet sich mit dem Substrat S zu einem ES-Komplex mit einer Geschwindigkeitskonstante k1. Der ES-Komplex hat zwei mögliche Schicksale. Er kann in E und S dissoziieren, mit einer Geschwindigkeitskonstante k-1, oder er kann ein Produkt P bilden, mit einer Geschwindigkeitskonstante k2. Auch hier gehen wir davon aus, dass fast kein Produkt zum Ausgangssubstrat zurückkehrt, eine Bedingung, die in der Anfangsphase einer Reaktion gilt, bevor die Produktkonzentration nennenswert ist.

Wir suchen einen Ausdruck, der die Katalyserate mit den Konzentrationen von Substrat und Enzym und den Raten der einzelnen Schritte in Beziehung setzt. Wir gehen davon aus, dass die katalytische Rate gleich dem Produkt aus der Konzentration des ES-Komplexes und k2 ist.

Nun müssen wir in Form bekannter Größen ausdrücken. Die Raten der Bildung und des Abbaus von ES sind gegeben durch:

Zur Vereinfachung arbeiten wir mit der Annahme eines stationären Zustands. In einem stationären Zustand bleiben die Konzentrationen der Zwischenprodukte, in diesem Fall , gleich, auch wenn sich die Konzentrationen der Ausgangsstoffe und Produkte ändern. Dies ist der Fall, wenn die Raten der Bildung und des Abbaus des ES-Komplexes gleich sind. Setzt man die rechten Seiten der Gleichungen 11 und 12 gleich, so erhält man

Durch Umstellen der Gleichung 13 erhält man

Gleichung 14 kann vereinfacht werden, indem man eine neue Konstante, KM, die so genannte Michaelis-Konstante, definiert:

Beachte, dass KM die Einheit der Konzentration hat. KM ist ein wichtiges Merkmal der Enzym-Substrat-Wechselwirkungen und ist unabhängig von der Enzym- und Substratkonzentration.

Das Einsetzen von Gleichung 15 in Gleichung 14 und das Lösen für ergibt

Nun wollen wir den Zähler von Gleichung 16 untersuchen. Die Konzentration des ungebundenen Substrats ist fast gleich der gesamten Substratkonzentration, vorausgesetzt, die Konzentration des Enzyms ist viel niedriger als die des Substrats. Die Konzentration des ungebundenen Enzyms ist gleich der gesamten Enzymkonzentration T minus der Konzentration des ES-Komplexes.

Setzt man diesen Ausdruck für in Gleichung 16 ein, so erhält man

Löst man Gleichung 18 für, so erhält man

oder

Setzt man diesen Ausdruck für in Gleichung 10 ein, erhalten wir

Die maximale Geschwindigkeit, Vmax, wird erreicht, wenn die katalytischen Stellen des Enzyms mit Substrat gesättigt sind, d. h. wenn = T.

Setzt man also Gleichung 22 in Gleichung 21 ein, erhält man die Michaelis-Menten-Gleichung:

Diese Gleichung erklärt die kinetischen Daten in Abbildung 8.11. Bei einer sehr niedrigen Substratkonzentration, die viel kleiner als KM ist, ist V0 = (Vmax/KM), d. h. die Geschwindigkeit ist direkt proportional zur Substratkonzentration. Bei hoher Substratkonzentration, wenn sie viel größer als KM ist, ist V0 = Vmax, d. h. die Geschwindigkeit ist maximal, unabhängig von der Substratkonzentration.

Die Bedeutung von KM ist aus Gleichung 23 ersichtlich. Wenn = KM, dann ist V0 = Vmax/2. KM ist also gleich der Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte ihres Maximalwertes beträgt. KM ist ein wichtiges Merkmal einer enzymkatalysierten Reaktion und ist für ihre biologische Funktion von Bedeutung.

Die physiologische Konsequenz von KM wird durch die Empfindlichkeit einiger Personen gegenüber Ethanol veranschaulicht. Diese Personen zeigen Gesichtsrötungen und eine schnelle Herzfrequenz (Tachykardie), nachdem sie auch nur geringe Mengen Alkohol zu sich genommen haben. In der Leber wird Ethanol durch Alkoholdehydrogenase in Acetaldehyd umgewandelt.

Normalerweise wird das Acetaldehyd, das in hohen Konzentrationen die Symptome verursacht, durch Acetaldehyddehyddehydrogenase zu Acetat verarbeitet.

Die meisten Menschen haben zwei Formen der Acetaldehyd-Dehydrogenase, eine mitochondriale Form mit niedrigem KM und eine zytosolische Form mit hohem KM. Bei anfälligen Personen ist das mitochondriale Enzym aufgrund der Substitution einer einzigen Aminosäure weniger aktiv, und Acetaldehyd wird nur von dem zytosolischen Enzym verarbeitet. Da dieses Enzym einen hohen KM-Wert hat, wird weniger Acetaldehyd in Acetat umgewandelt; überschüssiges Acetaldehyd entweicht ins Blut und ist für die physiologischen Auswirkungen verantwortlich.

8.4.1. Die Bedeutung der KM- und Vmax-Werte

Konzeptionelle Einblicke, Steady-State-Enzymkinetik

Lernen Sie, wie die kinetischen Parameter KMund Vmax mit Hilfe der Enzymkinetik-Laborsimulation in diesem Medienmodul experimentell bestimmt werden können.

Die Michaelis-Konstante, KM, und die maximale Geschwindigkeit, Vmax, lassen sich leicht aus Katalyseraten ableiten, die bei einer Vielzahl von Substratkonzentrationen gemessen wurden, wenn ein Enzym nach dem einfachen Schema in Gleichung 23 arbeitet. Die Ableitung von KM und Vmax wird am häufigsten mit Hilfe von Kurvenanpassungsprogrammen auf einem Computer durchgeführt (siehe Anhang zu diesem Kapitel für alternative Methoden zur Bestimmung von KM und Vmax). Die KM-Werte von Enzymen sind sehr unterschiedlich (Tabelle 8.5). Für die meisten Enzyme liegt KM zwischen 10-1 und 10-7 M. Der KM-Wert eines Enzyms hängt vom jeweiligen Substrat und von den Umgebungsbedingungen wie pH-Wert, Temperatur und Ionenstärke ab. Die Michaelis-Konstante, KM, hat zwei Bedeutungen. Zum einen ist KM die Konzentration des Substrats, bei der die Hälfte der aktiven Stellen besetzt ist. Die KM ist somit ein Maß für die Substratkonzentration, die für eine signifikante Katalyse erforderlich ist. Für viele Enzyme gibt es experimentelle Hinweise darauf, dass KM eine Annäherung an die Substratkonzentration in vivo darstellt. Wenn die KM bekannt ist, kann der Anteil der besetzten Stellen, fES, bei jeder Substratkonzentration aus

Tabelle 8.5

KM-Werte einiger Enzyme berechnet werden.

Zweitens steht KM in Beziehung zu den in Gleichung 9 angegebenen Geschwindigkeitskonstanten der einzelnen Schritte im katalytischen Schema. In Gleichung 15 ist KM definiert als (k-1 + k2)/k1. Betrachten wir einen Grenzfall, in dem k-1 viel größer ist als k2. Unter diesen Umständen dissoziiert der ES-Komplex viel schneller zu E und S als ein Produkt gebildet wird. Unter diesen Bedingungen (k-1 >> k2),

ist die Dissoziationskonstante des ES-Komplexes gegeben durch

Mit anderen Worten: KM ist gleich der Dissoziationskonstante des ES-Komplexes, wenn k2 viel kleiner ist als k-1. Wenn diese Bedingung erfüllt ist, ist KM ein Maß für die Stärke des ES-Komplexes: ein hohes KM weist auf eine schwache Bindung hin, ein niedriges KM auf eine starke Bindung. Es muss betont werden, dass KM die Affinität des ES-Komplexes nur dann angibt, wenn k-1 viel größer als k2 ist.

Die maximale Geschwindigkeit, Vmax, gibt die Umsatzzahl eines Enzyms an, d. h. die Anzahl der Substratmoleküle, die von einem Enzymmolekül in einer Zeiteinheit in ein Produkt umgewandelt werden, wenn das Enzym vollständig mit Substrat gesättigt ist. Sie ist gleich der kinetischen Konstante k2, die auch als kcat bezeichnet wird. Die maximale Geschwindigkeit, Vmax, gibt Aufschluss über die Umsatzzahl eines Enzyms, wenn die Konzentration der aktiven Stellen T bekannt ist, denn

und somit

Zum Beispiel katalysiert eine 10-6 M Lösung von Kohlensäureanhydrase die Bildung von 0,6 M H2CO3 pro Sekunde, wenn sie vollständig mit Substrat gesättigt ist. Daraus ergibt sich ein k2 von 6 × 105 s-1. Diese Umsatzzahl ist eine der größten bekannten. Jede katalysierte Reaktion findet in einer Zeit statt, die 1/k2 entspricht, d. h. 1,7 μs für Kohlensäureanhydrase. Die Umsatzzahlen der meisten Enzyme mit ihren physiologischen Substraten liegen im Bereich von 1 bis 104 pro Sekunde (Tabelle 8.6).

Tabelle 8.6

Maximale Umsatzzahlen einiger Enzyme.

8.4.2. Kinetische Perfektion in der enzymatischen Katalyse: Das kcat/KM-Kriterium

Wenn die Substratkonzentration viel größer als KM ist, ist die Katalyserate gleich kcat, der Umsatzzahl, wie in Abschnitt 8.4.1 beschrieben. Die meisten Enzyme sind jedoch normalerweise nicht mit Substrat gesättigt. Unter physiologischen Bedingungen liegt das /KM-Verhältnis normalerweise zwischen 0,01 und 1,0. Bei << KM ist die enzymatische Geschwindigkeit viel geringer als kcat, da die meisten aktiven Stellen unbesetzt sind. Gibt es eine Zahl, die die Kinetik eines Enzyms unter diesen typischen zellulären Bedingungen charakterisiert? In der Tat gibt es eine, wie durch Kombination der Gleichungen 10 und 16 gezeigt werden kann:

Wenn << KM, ist die Konzentration des freien Enzyms, , fast gleich der Gesamtkonzentration des Enzyms, also

Wenn << KM, hängt die enzymatische Geschwindigkeit von den Werten von kcat/KM, , und T ab. Unter diesen Bedingungen ist kcat/KM die Geschwindigkeitskonstante für die Wechselwirkung von S und E und kann als Maß für die katalytische Effizienz verwendet werden. Anhand der kcat/KM-Werte kann man beispielsweise die Vorliebe eines Enzyms für verschiedene Substrate vergleichen. Tabelle 8.7 zeigt die kcat/KM-Werte für mehrere verschiedene Substrate von Chymotrypsin (Abschnitt 9.1.1). Chymotrypsin hat eindeutig eine Präferenz für die Spaltung neben sperrigen, hydrophoben Seitenketten.

Tabelle 8.7

Substratpräferenzen von Chymotrypsin.

Wie effizient kann ein Enzym sein? Wir können uns dieser Frage nähern, indem wir feststellen, ob es physikalische Grenzen für den Wert von kcat/KM gibt. Man beachte, dass dieses Verhältnis von k1, k-1 und kcat abhängt, wie durch Ersetzen von KM gezeigt werden kann.

Angenommen, die Geschwindigkeit der Produktbildung (kcat) ist viel schneller als die Dissoziationsgeschwindigkeit des ES-Komplexes (k-1). Der Wert von kcat/KM nähert sich dann k1. Somit wird der Wert von kcat/KM letztlich durch k1, die Bildungsrate des ES-Komplexes, begrenzt. Diese Rate kann nicht schneller sein als das diffusionsgesteuerte Aufeinandertreffen eines Enzyms und seines Substrats. Die Diffusion begrenzt den Wert von k1, so dass er nicht höher als 108 bis 109 s-1 M-1 sein kann. Daher liegt die Obergrenze für kcat/KM zwischen 108 und 109 s-1 M-1.

Die kcat/KM-Verhältnisse der Enzyme Superoxid-Dismutase, Acetylcholinesterase und Triosephosphat-Isomerase liegen zwischen 108 und 109 s-1 M-1. Enzyme wie diese, deren kcat/KM-Verhältnisse an der oberen Grenze liegen, haben kinetische Perfektion erreicht. Ihre katalytische Geschwindigkeit wird nur durch die Geschwindigkeit begrenzt, mit der sie in der Lösung auf Substrat treffen (Tabelle 8.8). Eine weitere Steigerung der katalytischen Geschwindigkeit kann nur durch eine Verkürzung der Diffusionszeit erreicht werden. Es sei daran erinnert, dass die aktive Stelle nur einen kleinen Teil der gesamten Enzymstruktur ausmacht. Bei katalytisch perfekten Enzymen ist jedoch jede Begegnung zwischen Enzym und Substrat produktiv. In diesen Fällen können attraktive elektrostatische Kräfte auf das Enzym einwirken, die das Substrat zum aktiven Zentrum locken. Diese Kräfte werden manchmal poetisch als Circe-Effekt bezeichnet.

Circe-Effekt-

Die Nutzung von Anziehungskräften, um ein Substrat an eine Stelle zu locken, an der es eine Strukturumwandlung erfährt, wie von William P. Jencks, einem Enzymologen, definiert, der den Begriff prägte.

Als Göttin der griechischen Mythologie lockte Circe die Männer des Odysseus in ihr Haus und verwandelte sie dann in Schweine.

Tabelle 8.8

Enzyme, für die kcat/KM nahe der diffusionskontrollierten Begegnungsrate liegt.

Die durch die Diffusionsgeschwindigkeit in Lösung auferlegte Grenze kann teilweise auch dadurch überwunden werden, dass Substrate und Produkte in dem begrenzten Volumen eines Multienzymkomplexes eingeschlossen werden. Einige Enzymreihen sind in der Tat zu organisierten Verbänden zusammengeschlossen (Abschnitt 17.1.9), so dass das Produkt eines Enzyms sehr schnell von dem nächsten Enzym gefunden wird. In der Tat werden die Produkte von einem Enzym zum nächsten geschleust, ähnlich wie in einem Fließband.

8.4.3. Die meisten biochemischen Reaktionen umfassen mehrere Substrate

Die meisten Reaktionen in biologischen Systemen umfassen in der Regel zwei Substrate und zwei Produkte und können durch die Bisubstratreaktion dargestellt werden:

Die meisten dieser Reaktionen beinhalten die Übertragung einer funktionellen Gruppe, wie z. B. einer Phosphoryl- oder einer Ammoniumgruppe, von einem Substrat auf das andere. Bei Oxidations-Reduktionsreaktionen werden Elektronen zwischen Substraten übertragen. Mehrfachsubstratreaktionen lassen sich in zwei Klassen einteilen: sequentielle Verdrängung und doppelte Verdrängung.

Sequentielle Verdrängung

Beim sequentiellen Mechanismus müssen alle Substrate an das Enzym binden, bevor ein Produkt freigesetzt wird. Folglich bildet sich bei einer Bisubstrat-Reaktion ein ternärer Komplex aus dem Enzym und beiden Substraten. Es gibt zwei Arten von sequentiellen Mechanismen: geordnete Mechanismen, bei denen die Substrate in einer bestimmten Reihenfolge an das Enzym binden, und zufällige Mechanismen.

Viele Enzyme, die NAD+ oder NADH als Substrat haben, weisen den geordneten sequentiellen Mechanismus auf. Nehmen wir die Laktatdehydrogenase, ein wichtiges Enzym im Glukosestoffwechsel (Abschnitt 16.1.9). Dieses Enzym reduziert Pyruvat zu Laktat und oxidiert dabei NADH zu NAD+.

Beim geordneten sequentiellen Mechanismus bindet das Coenzym immer zuerst und das Laktat wird immer zuerst freigesetzt. Diese Abfolge kann in einer von W. Wallace Cleland entwickelten Notation wie folgt dargestellt werden:

Das Enzym liegt als ternärer Komplex vor: zunächst bestehend aus dem Enzym und den Substraten und nach der Katalyse aus dem Enzym und den Produkten.

Beim zufälligen sequentiellen Mechanismus ist die Reihenfolge der Zugabe der Substrate und der Freisetzung der Produkte zufällig. Sequentielle Zufallsreaktionen werden durch die Bildung von Phosphokreatin und ADP aus ATP und Kreatin veranschaulicht, eine Reaktion, die von der Kreatinkinase katalysiert wird (Abschnitt 14.1.5).

Phosphokreatin ist eine wichtige Energiequelle im Muskel. Sequentielle Zufallsreaktionen können auch in der Cleland-Notation dargestellt werden.

Auch wenn die Reihenfolge bestimmter Ereignisse zufällig ist, durchläuft die Reaktion dennoch die ternären Komplexe, die zunächst Substrate und dann Produkte enthalten.

Doppelverdrängungsreaktionen (Ping-Pong)

Bei Doppelverdrängungsreaktionen oder Ping-Pong-Reaktionen werden ein oder mehrere Produkte freigesetzt, bevor alle Substrate das Enzym binden. Kennzeichnend für Doppelverdrängungsreaktionen ist das Vorhandensein eines substituierten Enzymzwischenprodukts, bei dem das Enzym vorübergehend verändert ist. Reaktionen, bei denen Aminogruppen zwischen Aminosäuren und α-Ketosäuren ausgetauscht werden, sind klassische Beispiele für Doppelverschiebungsmechanismen. Das Enzym Aspartat-Aminotransferase (Abschnitt 23.3.1) katalysiert die Übertragung einer Aminogruppe von Aspartat auf α-Ketoglutarat.

Die Abfolge der Ereignisse kann wie folgt dargestellt werden.

Nach der Bindung von Aspartat an das Enzym entfernt das Enzym die Aminogruppe von Aspartat, um das substituierte Enzymzwischenprodukt zu bilden. Das erste Produkt, Oxalacetat, wird anschließend abgespalten. Das zweite Substrat, α-Ketoglutarat, bindet sich an das Enzym, nimmt die Aminogruppe des modifizierten Enzyms an und wird dann als Endprodukt, Glutamat, freigesetzt. In der Cleland-Schreibweise scheinen die Substrate auf dem Enzym auf- und abzuspringen, analog zu einem Ping-Pong-Ball, der auf einem Tisch abspringt.

8.4.4. Allosterische Enzyme gehorchen nicht der Michaelis-Menten-Kinetik

Das Michaelis-Menten-Modell hat die Entwicklung der Enzymchemie sehr gefördert. Seine Vorzüge sind Einfachheit und breite Anwendbarkeit. Allerdings kann das Michaelis-Menten-Modell die kinetischen Eigenschaften vieler Enzyme nicht erklären. Eine wichtige Gruppe von Enzymen, die nicht der Michaelis-Menten-Kinetik gehorchen, sind die allosterischen Enzyme. Diese Enzyme bestehen aus mehreren Untereinheiten und mehreren aktiven Stellen.

Allosterische Enzyme zeigen oft sigmoidale Verläufe (Abbildung 8.14) der Reaktionsgeschwindigkeit V0 gegenüber der Substratkonzentration und nicht die hyperbolischen Verläufe, die von der Michaelis-Menten-Gleichung (Gleichung 23) vorhergesagt werden. Bei allosterischen Enzymen kann die Bindung eines Substrats an eine aktive Stelle die Eigenschaften anderer aktiver Stellen in demselben Enzymmolekül beeinflussen. Ein mögliches Ergebnis dieser Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten ist, dass die Bindung von Substrat kooperativ wird, d. h. die Bindung von Substrat an eine aktive Stelle des Enzyms erleichtert die Substratbindung an die anderen aktiven Stellen. Wie in Kapitel 10 erläutert wird, führt eine solche Kooperativität zu einem sigmoidalen Verlauf von V0 gegen . Darüber hinaus kann die Aktivität eines allosterischen Enzyms durch regulatorische Moleküle verändert werden, die reversibel an bestimmte andere Stellen als die katalytischen Stellen gebunden sind. Die katalytischen Eigenschaften allosterischer Enzyme können somit an die unmittelbaren Bedürfnisse einer Zelle angepasst werden (Kapitel 10). Aus diesem Grund sind allosterische Enzyme wichtige Regulatoren von Stoffwechselwegen in der Zelle.

Abbildung 8.14

Kinetik eines allosterischen Enzyms. Allosterische Enzyme zeigen eine sigmoidale Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration.

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