Zawartość i właściwości płynu wewnątrzkomórkowego

Ten rozdział jest niejasno związany z Sekcją E(iv) Syllabusa 2017 CICM Primary, który oczekuje od kandydata na egzamin „opisania składu …płynu wewnątrzkomórkowego”. Ponieważ jest to sekcja dotycząca fizjologii komórkowej, nacisk zostanie tu położony głównie na mikro poziom organizacji, a wszelkie dyskusje na temat wewnątrzkomórkowego przedziału płynu ustrojowego zostaną pozostawione dla sekcji Body Fluids.

Fakt, że egzaminatorzy college’u nigdy nie skupili swojego oka na tym temacie nadaje niemal wyzwalające powietrze bezcelowości do dyskusji o nim, ponieważ zarówno kandydaci na egzamin, jak i autor są przyjemnie świadomi, że każdy z nich marnuje czas drugiego. Zamiast przyswajać twardą naukę i zapamiętywać fakty nadające się do egzaminu, można spokojnie czytać dalej z powodów czysto rozrywkowych, lub przeskoczyć do tematów, które przyciągają więcej punktów.

Podsumowując:

Jakie są ważne recenzowane źródła na ten temat? Niestety, jest ich wiele. Kiedy ktoś korzysta z wyszukiwarki lub sekcji indeksu podręcznika, aby szukać „płyn wewnątrzkomórkowy”, nieuchronnie pojawia się odpowiedź, seria wpisów lub stron lub slajdów PowerPoint, które – choć wszystkie niejasno podobne w swojej treści – różnią się w ich cytowanych wartości i nie oferują nic w sposób odniesienia. Wiele z nich nie oferuje w ogóle żadnych użytecznych informacji. Na przykład, zwracając się do oficjalnych książek uczelni na ten temat (Ganong, s.2 z 23 edycji, i Guyton & Hall, s. 4 z 13 edycji), można znaleźć stężenia elektrolitów cytozolowych omawiane przy użyciu terminów takich jak „duże ilości”. Nawet poza oficjalną bibliografią, inaczej solidne oferty, takie jak Molecular Biology of the Cell, nie mają prostych odpowiedzi. Oni nie mogą nawet zgodzić się na to, co to nazwać (cytosol? Protoplazma? Primordialschlauch?)

Na szczęście są jeszcze naukowcy tam, którzy publikują na ten temat. Prawdopodobnie najlepszy artykuł jest 1999 kawałek przez Katherine Luby-Phelps, który w zasadzie zawiera wszystko, co może być potrzebne, aby odpowiedzieć na wszelkie hipotetyczne przyszłe SAQs na ten temat. Innym doskonałym wpisem dotyczącym głównie właściwości materiału wewnątrzkomórkowego jest krótka praca Richarda P. Seara (2005). Jeśli ktoś jest naprawdę szalony i dysponuje zasobami czasowymi specjalisty zatrudnionego na stałe (tzn. nie ma pilnego obowiązku wykonywania jakiejkolwiek użytecznej pracy), może zamiast tego zapoznać się z In Search of the Physical Basis of Life (1984) Gilberta Linga, 800-stronicową książką napisaną przez człowieka, którego publikacje na temat fizjologii komórki sięgają lat 50-tych.

Objętość przestrzeni wewnątrzkomórkowej

Jak duża jest komórka? Oczywiście, to zależy od komórki. Dobrym przykładem komórki nietypowej jest oocyt Xenopus, jajo afrykańskiej ropuchy szponiastej, które ma 1 mm średnicy. Przy omawianiu ludzi, jeden zwykle odnosi się do płynu wewnątrzkomórkowego, jak gdyby to było stosunkowo jednorodne wiadro, ale w rzeczywistości, że przedział płyn składa się z czegoś w rodzaju 1014 miniscule przedziałów, z których każdy ma nieco inną objętość i composition.

The heterogeniczność wszystkich tych objętości jest dobrze podsumowane w tym rozdziale BioNumbers bazy danych, gdzie wszystkie sposoby skrupulatnie odniesione informacje można znaleźć. To jest reprodukowane tutaj z minimalną modyfikacją, w przypadku, gdy serwery Harvard kiedykolwiek awarii.

Volumes of Mammalian Cells

Cell type	Volume (μm3, lub femtolitry)	Objętość (pikolitry)	Referencja
Komórka spermy	30	0.03	Gilmore et al, 1995
Erytrocyt	100	0.1	Ballas et al, 1987
Limfocyt	130	0.13	Schmid-Schonbein et al, 1980
Neutrofil	300	0.3	Rosengren et al, 1994
Pancreatic β-cell	1,000	1.0	Finegood et al, 1995
Enterocyt	1,400	1,4	Wiśniewski et al, 2012
Fibroblast	2,000	2.0	Mitsui et al, 1976
Guz szyjki macicy (HeLa)	3,000	3.0	Zhao et al, 2008
Komórka włosa (ucho)	4,000	4.0	Géléoc et al, 1999
Osteoblast	4,000	4.0	Beck et al, 2011
Makrofag pęcherzykowy	5,000	5.0	Krombach et al, 1997
Kardiomiocyt	15,000	15.0	Calvillo et al, 2003
Megakariocyt	30,000	30.0	Harker et al, 2000
Adipocyt	60,000	60.0	Livingston et al, 1984
Oocyt	4,000,000	4000	Goyanes et al, 1990

Więc jest to dość szeroki zakres. Co więcej, oczywiście nie cała zawartość komórki będzie zajęta przez „płyn wewnątrzkomórkowy”, niezależnie od tego, jaka jest Twoja definicja tego terminu. Na przykład, dla celów tego rozdziału, definicja płynu wewnątrzkomórkowego będzie brzmiała „zawartość wewnątrzkomórkowa, która nie jest organellami”, wyłącznie dlatego, że organelle są omawiane w innym rozdziale. To, o czym mówimy, w tym przypadku, to „szarawa, lepka, oślizgła, półtransparentna i półpłynna substancja”, która zajmuje przestrzeń wewnątrzkomórkową pomiędzy innymi strukturami (Harvey, 1937).

Zależnie od tego, na jaki rodzaj komórki patrzymy, ta przestrzeń może być bardzo małą częścią całkowitej objętości. Na przykład, w wyżej wymienionym adipocycie omentalnym, z tych 60 pikolitrów całkowitej objętości, zdecydowana większość będzie zajęta przez pozbawiony wody tłuszcz. Można to udowodnić doświadczalnie: DiGirolamo & Owens (1976) byli w stanie obliczyć, że objętość wody w adipocytach szczura wynosiła około 5-7% całkowitej objętości, czyli 1,5-2 pikolitrów.

W skrócie, patrzymy na bardzo małą objętość. Dlaczego to ma znaczenie? Otóż. Wewnętrzna płynna 1-2 pikolitrowa objętość komórki jest objętością dystrybucji dla substancji rozpuszczalnych. Cząsteczki tych substancji mają więc do pokonania bardzo krótki dystans, zanim spotkają się ze sobą. Skutkiem tego jest zwiększenie szybkości reakcji, co jest pomocne, ponieważ całkowita ilość cząsteczek reagentów dla tak małej objętości jest z konieczności niewielka. Zapożyczając przykład z Luby-Phelps (2000), jeśli komórka ma całkowitą zawartość 1 nanomola białka, oznacza to, że w komórce znajduje się tylko 1000 kopii tego białka. Na szczęście, przy tak małej objętości do przebycia, cząsteczka wiążąca o nawet niskim powinowactwie byłaby w stanie wyszorować i zaadsorbować większość dostępnego substratu.

Zawartość białek w płynie wewnątrzkomórkowym

Ok, więc objętość jest mała. Jakie makromolekuły się w nim znajdują i ile ich jest? Alice B. Fulton (1982) zważyła się na to z prawdopodobnie najbardziej przejrzystą odpowiedzią w opublikowanej literaturze. Zasadniczo, zawartość białka w komórkach jest w zakresie od 17 do 35% wagowych, z większością autorów mieszczących się w zakresie gdzieś tak 20-30g/100ml. Fulton cytuje starożytne teksty (Loewy et al, 1969), aby dać następujące wartości:

• Komórki mięśniowe: 23% białka wagowo
• Erytrocyty: 35% białka wagowo
• Większość innych komórek: 17% do 26% białka wagowo

Pomiary są zwykle wykonywane przez pomiary współczynnika załamania światła, który jest techniką, która nie zwykle rozróżnić między białek strukturalnych (np. te, z których cytoszkielet i organelle są złożone) i rozpuszczalnych białek, które stanowią resztę goo.

Więc, co jest punktem tej dyskusji? Cóż. To stężenie białka jest dość wysoki. To jest powyżej zwykle akceptowane stężenie dużych polimerów, które można się spodziewać, aby wpłynąć na dyfuzję innych polimerów jak, tj. las jest zbyt gęsty. Chang et al (1987) stworzyli model matematyczny, który przewiduje, że dla polimerów o masie 50kDa i większej, granica dyfuzji wynosi około 130g/L, tzn. więcej niż to, a inne polimery nie będą mogły łatwo dyfundować przez roztwór. Jasne, oni używali polistyrenu rozpuszczonego w benzenie, ale fakt pozostaje faktem. Dla porównania, gdy jeden w pełni krystalizuje białko, kończy się z „ciała stałego”, który jest tylko 40% białka wagowo

Podsumowując, białka w płynie wewnątrzkomórkowym są pakowane razem tak ściśle, że cytosol musi być opisany jako „zatłoczone rozwiązanie”. Karykaturalny diagram tutaj (pierwotnie opublikowany przez Goodsell w 1993 r., a następnie odtworzony przez praktycznie każdego, kto kiedykolwiek pisał o cytozolu) pokazuje wizualnie dokładnie, jak blisko upakowane są te ciała. Rysunek został przybliżony, przy użyciu znanych rozmiarów i kształtów cząsteczek/mikroskopu elektronowego, ale zdjęcia wykonane przez SEM (np. przez Bridgman & Reese, 1984) pokazują, że prawidłowo przedstawia on nieporządną mikrostrukturę cytozolu. Patrząc na oocyty Xenopus przy powiększeniu ~ 80,000, widoczny staje się gęsty las włókien i granulek. Zdjęcie tutaj (część rysunku 6) zostało w rzeczywistości oczyszczone przez lizę komórek i płukanie detergentem, aby usunąć część ładunku białkowego, który w przeciwnym razie przesłonił drobniejszą strukturę. Strzałki wskazują na filamenty Y i T-junctions.

Bez przygotowania detergentu, cały drobny ziarnisty materiał zapakowany pomiędzy tymi filamentami staje się widoczny. Obraz przypomina teraz biały szum (ci sami autorzy).

Jasne jest, że dyfuzja przez tę gęstwinę nie będzie normalna. Mniejsze soluty (np. twoje jony sodu i potasu) muszą poruszać się wokół tych ogromnych przeszkód, wybierając malowniczą drogę do siebie. Z praktycznego punktu widzenia powinno to oznaczać, że każda reakcja, która zależy od szybkości dyfuzji, będzie przebiegać wolniej. Jeśli cząsteczki potrzebują więcej czasu, aby dotrzeć do siebie nawzajem, to z pewnością szybkość netto ich interakcji powinna być mniejsza. Jednakże, nie widzimy tego.

Jakie właściwości chemiczne widzimy, z tym wysoce nasyconym proteinaceous zupy? Allen P. Minton (2006) podsumował lata (głównie jego własne) badania w tabeli wyżej wymienionego papieru. Jest streszczony tutaj:

• Zwiększone powinowactwo wiązania inaczej rozcieńczonych makrocząsteczek do siebie
• Przyspieszenie stowarzyszeń białkowych np. self-assembly
• Deceleration of diffusion-limited reactions and protein associations
• Stabilisation of proteins against heat denaturation

Podsumowując, tłoczenie zmusza białka do składania i interakcji, która produkuje złożone konfiguracje, które byłyby inaczej niemożliwe w rozcieńczonym roztworze. Na przykład, Wilf & Minton w 1981 roku odkrył, że rozcieńczone cząsteczki mioglobiny w roztworze mają niewielkie zainteresowanie sobą, ale dodanie 10% roztworu (jakiegokolwiek!) innego białka powoduje, że mioglobina spontanicznie składa się w dimery.

Właściwości wody wewnątrzkomórkowej

Nawet w skrystalizowanym białku, tylko 40% masy stanowi rzeczywiste białko. Reszta to rozpuszczalnik, który zajmuje przestrzenie między upakowanymi cząsteczkami białka (nie są one dokładnie prostokątami i nie układają się równo). Kiedy rozpuszczalnikiem jest woda, połowa z niej jest adsorbowana na powierzchni białka, ale reszta może być nadal postrzegana jako normalna ciekła woda. W tym cienkim filmie, jony wody wewnątrzkomórkowej są rozpuszczane.

Wyraźnie, z związaną wodą adsorbowaną, rzeczy są nieco inne. Na przykład, właściwości rozpuszczalnika tej wody nie będą dokładnie takie same jak „wolnej” wody. Po pierwsze, będzie ona prawdopodobnie miała zmniejszoną aktywność chemiczną. Jak można się spodziewać, „uporządkowany” stan wody nadaje jej kilka niezwykłych właściwości koligacyjnych – na przykład, Foster et al (1976) odkryli, że jej temperatura zamarzania jest obniżona. Co więcej, będą kieszenie cytozolu o zwiększonej aktywności (wokół hydrofilowych struktur białkowych) i zmniejszonej aktywności (wokół hydrofobowych).

Jak dużo wody jest utrzymywane w tym stanie niewoli przez białka? To jest nieco trudne do powiedzenia. Eksperymenty Ling et al (1993) sugerują, że wewnątrz komórek, większość wody jest „zamówiony” w ten sposób, ale większość eksperymentów sprawozdawczości na ten temat są nieco dotknięte przez fakt, że surowe żywe komórki używają mają różne odpowiedzi homeostatyczne do warunków eksperymentalnych, które confound the findings.

Generalnie, ludzie próbują ustalić tę odpowiedź przez osmotycznie odwodnienia komórek. Zastosuj ciśnienie osmotyczne, rozumują, i cała „ruchoma” woda powinna wyjść z komórki. Następnie mierzy się zawartość wody w komórce, a wszystko, co pozostało, musi być „nieruchome”, zaparkowane na powierzchni cząsteczek białka i niezdolne do migracji w odpowiedzi na ciśnienie osmotyczne. Cameron et al (1997) przedstawiają wykres (skradziony bezwstydnie i wyświetlony tutaj, po lewej stronie), gdzie zawartość wody w pozostałych komórkach jest wykreślona na osi x rosnącego ciśnienia osmotycznego. Linia ciśnienia w stosunku do pozostałej wody, gdy ekstrapolowana z dowodów eksperymentalnych i przedłużona w kierunku „nieskończonego” ciśnienia osmotycznego, kończyła się przecięciem osi y w jakimś niezerowym punkcie. W zależności od tego, co komórki były używane, że skończyło się gdzieś między 30-90% całkowitej zawartości water.

W rzeczywistości wydaje się, że ta woda adsorbowana na białkach jest niezbędna woda w komórkach, a wszystkie „wolne” woda jest bezcelowe balast. Clegg (1981), rehydrating niektóre suszone komórki krewetki solankowe, stwierdził, że aktywność metaboliczna wznowione i było stosunkowo normalne, gdy komórki zostały przywrócone z około 35% wody wagowo. tj. o tyle, ile oczekuje się „hydratacji” wszystkie makrocząsteczki. W tych krewetkach prawie na pewno nie było wolnej wody w „fazie sypkiej”. Jasne, nie próbowały się rozmnażać ani syntetyzować RNA (to wymagało uwodnienia do 70-80%), ale ich synteza aminokwasów i wymiana gazowa przebiegały względnie normalnie. To sprawia, że wszystkie bardziej niezwykły fakt, że gdy mierzone obiektywnie, to gęsta 20-30% zupa białka ma lepkość, która ściśle przypomina normalnej wody (Luby-Phelps, 1994)

Płyn wewnątrzkomórkowy pH

Carter (1972) opublikował bardzo wpływowy artykuł na ten temat, który jest często cytowany w podręcznikach fizjologii człowieka, mimo że autor używał mięśni pąkli olbrzymiej (Balanus nubilus), które zawiesił w czymś, co nazywa się „roztworem Ringera pąkli”, solanką z 450 mmol/L sodu i 518 mmol/L chlorku w niej. Trudno czytać dalej z jakimkolwiek poziomem szacunku dla ludzkiego uogólnienia takich danych, ale jeśli ktoś to zrobi, odkryje najważniejszy wniosek: że pH w komórkach jest podzielone na przedziały tak bardzo, że różne regiony cytozolu miały szalenie różne wartości pH, w zakresie od 6,0 do 7,5.

Wewnątrzkomórkowe stężenia elektrolitów

Generalnie, wszystkie podręczniki, gdy zapytany o stężenie elektrolitów w płynie wewnątrzkomórkowym, będzie produkować Gamblegram jak to (przywłaszczone z Ling, 1984, bez zgody jego majątku lub jego wydawcy).

Ten diagram tutaj nie ma odniesienia w książce Linga, ale można argumentować, że nie musi być, biorąc pod uwagę, że Ling wykonał praktycznie całą przełomową pracę nad określeniem zachowania rozpuszczalników wewnątrzkomórkowych. W szczególności, w latach 60-tych, on i Ochsenfeld ustalili, że ten potas (i wszystkie inne elektrolity w cytozolu) generalnie nie jest obecny w swobodnie dostępnej formie, ale zamiast tego jest adsorbowany na strukturach makromolekularnych.

Badacze rzucili wyzwanie komórkom znakowanym izotopami promieniotwórczymi i stwierdzili, że miało to niewielki wpływ na wyparcie elektrolitów już tam obecnych, co byłoby oczekiwane, gdyby były one swobodnie dystrybuowane. Wewnątrzkomórkowe elektrolity są w dużej mierze obecne w kompleksach z makromolekułami i są znacznie mniej mobilne niż można by się spodziewać po modelu komórki, w którym cała zawartość istnieje w jednorodnym wodnistym worku. Ci sami autorzy (Ling & Ochsenfeld, 1973) potwierdzili później, że ruchliwość potasu z przedziału wewnątrzkomórkowego do pozakomórkowego wynosi około jednej ósmej tego, czego można by się spodziewać na podstawie prostej dyfuzji w roztworze wolnym. Zabity mięsień żaby wyciekł potasu nieco łatwiej (szybkość dyfuzji została zmniejszona tylko o 25% od oczekiwanej), ponieważ pompy zasilane ATP przestały działać, a struktura białek uległa dezorganizacji.

Więc zgódźmy się, że te jony nie są rozpuszczone w chlupoczącym jeziorze wolnej wody wewnątrzkomórkowej, ale raczej związane w kompleksach. To wciąż nie odpowiada na pytanie: ile czego tam jest? Okazuje się, że odpowiedź na to pytanie jest stosunkowo łatwa. Znacznie łatwiej niż na którekolwiek z innych pytań poruszonych do tej pory w tym rozdziale. Wystarczy pobrać cytozol, wysuszyć go liofilizatem, a następnie zmierzyć skład pierwiastkowy suchej masy. Mason et al (1981) zrobił dokładnie to dla niektórych komórek kanalików nerkowych, przed i po urazie niedokrwiennym. Ich ustalenia są reprodukowane poniżej, zarówno w formie oryginalnej tabeli 1981 i ładny błyszczący Gamblegram:

Jak widać z dzikich wahań stężenia potasu po nawet 20 minut niedokrwienia, skład elektrolitów komórek jest znacznie bardziej płynny niż ten z płynu zewnątrzkomórkowego (gdzie 20mmol zmiana w stężeniu każdego elektrolitu byłoby słabo tolerowane, w egzystencjalnej organizmu przetrwania rodzaju poziomu). Na dodatek, każda linia komórkowa będzie miała nieco inne stężenie jonów wewnątrzkomórkowych. To powoduje nieprecyzyjność wartości elektrolitów wewnątrzkomórkowych omawianych w podręcznikach i ich ogólną niechęć do podawania jakichkolwiek liczb. Praktycznie każda liczba, którą podasz, będzie błędna. Na przykład, dystalne kanaliki Masona miały 11mmol/L sodu w swoim cytozolu, ale Poole-Wilson (1975) znalazł około 44mmol/L w miocytach lewej komory i 20mmol/L w lewym mięśniu czworogłowym. Alam et al (1977) podają wartości około 25 mmol/L dla sodu i 145 mmol/L dla potasu w niektórych komórkach niewydolnej wątroby. Krótko mówiąc, niechlujne i nieprzewidywalne środowisko każdej danej komórki utrudnia podanie konkretnych liczb.