Contenu et propriétés du fluide intracellulaire

Ce chapitre est vaguement pertinent pour la section E(iv) du Syllabus primaire du CICM 2017, qui attend du candidat à l’examen qu’il « décrive la composition…du fluide intracellulaire ». Comme il s’agit de la section sur la physiologie cellulaire, l’accent sera mis ici principalement sur le niveau micro de l’organisation, et toute discussion sur le compartiment des fluides corporels intracellulaires sera laissée pour la section Fluides corporels.

Le fait que les examinateurs du collège n’aient jamais focalisé leur Regard sur ce sujet confère un air presque libérateur d’inutilité à la discussion de celui-ci, car les candidats à l’examen et l’auteur sont agréablement conscients que chacun perd le temps de l’autre. Plutôt que de s’imprégner de la science dure et de mémoriser des faits examinables ici, on peut facilement lire la suite pour des raisons purement médico-divertissantes, ou passer directement à des sujets qui attirent plus de points.

En résumé :

Quelles sont les ressources valides évaluées par des pairs pour ce sujet ? Malheureusement, elles sont nombreuses. Lorsque l’on utilise un moteur de recherche ou la section index d’un manuel pour rechercher « fluide intracellulaire », on trouve inévitablement une réponse, une série d’entrées ou de pages ou de diapositives Powerpoint qui – bien que toutes vaguement similaires dans leur contenu – diffèrent dans leurs valeurs citées et n’offrent rien en termes de références. Beaucoup n’offrent aucune information utile. Par exemple, dans les ouvrages universitaires officiels sur le sujet (Ganong, p. 2 de la 23e édition, et Guyton & Hall, p. 4 de la 13e édition), on trouve des termes tels que « grandes quantités » pour parler des concentrations d’électrolytes cytosoliques. Même en dehors de la bibliographie officielle, des ouvrages par ailleurs solides comme Molecular Biology of the Cell n’ont pas de réponses claires. Ils ne peuvent même pas se mettre d’accord sur le nom à lui donner (cytosol ? Protoplasme ? Primordialschlauch ?)

Heureusement, il y a encore des scientifiques qui publient sur ce sujet. Le meilleur article est probablement celui de 1999 de Katherine Luby-Phelps, qui contient essentiellement tout ce dont vous pourriez éventuellement avoir besoin pour répondre à d’hypothétiques futurs QSA sur ce sujet. Un autre excellent article traitant principalement des propriétés de la matière intracellulaire est le court article de Richard P. Sear (2005). Si l’on est vraiment fou et que l’on dispose des ressources en temps d’un spécialiste du personnel sous contrat permanent (c’est-à-dire sans obligation urgente d’effectuer réellement un travail utile), on peut plutôt explorer In Search of the Physical Basis of Life (1984) de Gilbert Ling, un livre de 800 pages écrit par un homme dont les publications sur la physiologie cellulaire s’étendent jusque dans les années 1950.

Volume d’un espace intracellulaire

Combien une cellule est-elle grande ? Évidemment, cela dépend de la cellule. Un bon exemple de valeur aberrante est l’ovocyte de Xenopus, l’œuf d’un crapaud à griffes africain qui fait 1mm de diamètre. Lorsqu’on parle des humains, on fait généralement référence au fluide intracellulaire comme s’il s’agissait d’un seau relativement homogène, mais en fait, ce compartiment de fluide est composé de quelque chose comme 1014 compartiments minuscules dont chacun a un volume et une composition légèrement différents.

L’hétérogénéité de tous ces volumes est bien résumée dans ce chapitre de la base de données BioNumbers, où l’on peut trouver toutes sortes d’informations méticuleusement référencées. Il est reproduit ici avec une modification minimale, au cas où les serveurs de Harvard tomberaient un jour en panne.

Volumes des cellules de mammifères

Type de cellule	Volume (μm3, ou femtolitres)	Volume (picolitres)	Référence
Cellule spermatique	30	0.03	Gilmore et al, 1995
Erythrocyte	100	0.1	Ballas et al, 1987
Lymphocyte	130	0,13	Schmid-Schonbein et al, 1980
Neutrophile	300	0.3	Rosengren et al, 1994
Cellule β pancréatique	1,000	1.0	Finegood et al, 1995
Entérocyte	1 400	1,4	Wiśniewski et al, 2012
Fibroblaste	2 000	2.0	Mitsui et al, 1976
Tumeur cervicale (HeLa)	3,000	3.0	Zhao et al, 2008
Cellule capillaire (oreille)	4,000	4.0	Géléoc et al, 1999
Ostéoblaste	4,000	4.0	Beck et al, 2011
Macrophage alvéolaire	5,000	5.0	Krombach et al, 1997
Cardiomyocyte	15 000	15,0	Calvillo et al, 2003
Mégacaryocyte	30 000	30.0	Harker et al, 2000
Adipocyte	60 000	60.0	Livingston et al, 1984
Oocyte	4 000 000	4000	Goyanes et al, 1990

C’est donc une gamme assez large. De plus, il est évident que tout le contenu de la cellule ne sera pas occupé par le « fluide intracellulaire », quelle que soit votre définition de ce terme. Par exemple, pour les besoins de ce chapitre, la définition du fluide intracellulaire sera « le contenu intracellulaire qui n’est pas un organite », uniquement parce que les organites sont abordés dans un autre chapitre. Ce dont nous parlons, dans ce cas, c’est de la « substance grisâtre, visqueuse, gluante, semi-transparente et semi-fluide » qui occupe l’espace intracellulaire entre d’autres structures (Harvey, 1937).

Selon le type de cellule que vous regardez, cet espace pourrait être une très petite proportion du volume total. Par exemple, dans l’adipocyte omental susmentionné, sur ces 60 picolitres de volume total, la grande majorité sera occupée par de la graisse sans eau. Ceci peut être prouvé expérimentalement : DiGirolamo & Owens (1976) ont pu calculer que le volume d’eau dans les adipocytes de rat était d’environ 5 à 7% du volume total, soit 1,5 à 2 picolitres.

En bref, nous sommes face à un très petit volume. En quoi cela est-il important ? Eh bien. Le volume liquide interne de la cellule de 1-2 picolitres est le volume de distribution des substances solubles. Les molécules de ces substances ont donc une très courte distance à parcourir avant de se rencontrer. L’effet est d’augmenter la vitesse des réactions, ce qui est utile car la quantité totale de molécules de réactifs pour un si petit volume est nécessairement petite. Pour emprunter un exemple à Luby-Phelps (2000), si une cellule contient au total 1 nanomole d’une protéine, cela signifie qu’il n’y a que 1000 copies de cette protéine présentes dans la cellule. Heureusement, avec un si petit volume à traverser, une molécule de liaison, même de faible affinité, serait capable de frotter et d’adsorber la majorité du substrat disponible.

Contenu protéique du fluide intracellulaire

Ok, donc le volume est petit. Quelles sont les macromolécules qu’il contient, et combien sont-elles ? Alice B. Fulton (1982) a pesé sur cette question avec probablement la réponse la plus lucide de la littérature publiée. En gros, la teneur en protéines des cellules se situe dans une fourchette de 17 à 35% en poids, la plupart des auteurs se situant dans une fourchette de 20 à 30g/100ml. Fulton cite des textes anciens (Loewy et al, 1969) pour donner les valeurs suivantes:

• Cellules musculaires : 23% de protéines en poids
• Erythrocytes : 35% de protéines en poids
• La plupart des autres cellules : 17% à 26% de protéines en poids

Les mesures sont généralement effectuées par des mesures d’indice de réfraction qui est une technique qui ne permet généralement pas de discriminer entre les protéines structurelles (par exemple celles dont sont composés le cytosquelette et les organelles) et les protéines solubles qui constituent le reste du goo.

Alors, quel est l’intérêt de cette discussion ? Eh bien. Cette concentration de protéines est assez élevée. Elle est supérieure à la concentration habituellement acceptée de grands polymères qui devraient affecter la diffusion d’autres polymères similaires, c’est-à-dire que la forêt est trop dense. Chang et al (1987) ont produit un modèle mathématique qui prédit que pour les polymères de 50kDa et plus, la limite de diffusion est d’environ 130g/L, c’est-à-dire qu’au-delà, les autres polymères ne pourront pas diffuser facilement dans la solution. Bien sûr, ils utilisaient du polystyrène dissous dans du benzène, mais le fait demeure. A titre de comparaison, lorsqu’on cristallise entièrement une protéine, on se retrouve avec un « solide » qui n’est constitué que de 40% de protéines en poids

En résumé, les protéines du fluide intracellulaire sont serrées les unes contre les autres de façon si étroite que le cytosol doit être décrit comme une « solution encombrée ». Le diagramme caricatural présenté ici (publié à l’origine par Goodsell en 1993, et reproduit par la suite par pratiquement tous ceux qui ont écrit sur le cytosol) montre visuellement à quel point ces corps sont serrés. Le dessin était approximatif, utilisant des tailles et des formes connues de molécules/ microscope électronique, mais les images prises au MEB (par exemple par Bridgman & Reese, 1984) démontrent qu’il représente correctement la microstructure désordonnée du cytosol. En observant des ovocytes de Xenopus à un grossissement de ~ 80 000, une forêt dense de filaments et de granules devient apparente. L’image présentée ici (une partie de la figure 6) a été un peu nettoyée par lyse cellulaire et lavage au détergent, afin d’éliminer une partie de la charge protéique qui aurait autrement masqué la structure plus fine. Les flèches pointent vers les jonctions Y et T des filaments.

Sans préparation détergente, tout le matériel granulaire fin emballé entre ces filaments devient visible. L’image ressemble maintenant à un bruit blanc (mêmes auteurs).

Il est clair que la diffusion à travers ce fourré ne va pas être normale. Les solutés plus petits (par exemple, vos ions sodium et potassium) doivent naviguer autour de ces énormes obstacles, en prenant la route panoramique vers l’autre. D’un point de vue pratique, cela signifie que toute réaction qui dépend de la vitesse de diffusion sera plus lente. Si les molécules mettent un temps fou à se rejoindre, le taux net de leur interaction devrait sûrement être réduit. Cependant, nous ne voyons pas cela.

Quelles propriétés chimiques voyons-nous, avec cette soupe protéique hautement saturée ? Allen P. Minton (2006) a résumé des années de recherche (principalement la sienne) dans un tableau de l’article susmentionné. Il est résumé ici:

• Augmentation de l’affinité de liaison de macromolécules autrement diluées les unes pour les autres
• Accélération des associations de protéines ex. auto-assemblage
• Décélération des réactions limitées par la diffusion et des associations de protéines
• Stabilisation des protéines contre la dénaturation thermique

En résumé, l’encombrement force les protéines à se replier et à interagir, ce qui produit des configurations complexes qui seraient autrement impossibles dans une solution diluée. Par exemple, Wilf & Minton en 1981 a découvert que les molécules de myoglobine diluées en solution ont peu d’intérêt les unes pour les autres, mais l’ajout d’une solution à 10% de (n’importe quelle !) autre protéine provoque l’assemblage spontané de la myoglobine en dimères.

Propriétés de l’eau intracellulaire

Même dans une protéine cristallisée, seuls 40% de la masse sont des protéines réelles. Le reste est du solvant qui occupe les espaces entre les molécules de protéines emballées (elles ne sont pas exactement rectangulaires, et ne s’empilent pas proprement). Lorsque le solvant est de l’eau, la moitié de celle-ci finit par être adsorbée sur la surface de la protéine, mais le reste peut toujours être considéré comme de l’eau liquide normale. Dans ce film mince, les ions de l’eau intracellulaire sont dissous.

Il est clair qu’avec l’eau adsorbée liée, les choses sont légèrement différentes. Par exemple, les propriétés de solvant de cette eau ne vont pas être exactement les mêmes que celles de l’eau « libre ». D’une part, elle aura probablement une activité chimique réduite. Comme on peut s’y attendre, l’état « ordonné » de l’eau lui confère plusieurs propriétés colligatives inhabituelles – par exemple, Foster et al (1976) ont constaté que son point de congélation est abaissé. De plus, il va y avoir des poches de cytosol avec une activité accrue (autour des structures protéiques hydrophiles) et une activité réduite (autour des structures hydrophobes).

Quel pourcentage de l’eau est maintenu dans cet état captif par les protéines ? C’est quelque peu difficile à dire. Les expériences de Ling et al (1993) suggèrent qu’à l’intérieur des cellules, la plupart de l’eau est « ordonnée » de cette façon, mais la plupart des expériences rapportant ce sujet sont quelque peu affectées par le fait que les cellules vivantes brutes qu’elles utilisent ont diverses réponses homéostatiques aux conditions expérimentales qui confondent les résultats.

Généralement, les gens essaient d’établir cette réponse en déshydratant osmotiquement les cellules. Appliquer une pression osmotique, raisonnent-ils, et toute l’eau « mobile » devrait sortir de la cellule. Ensuite, vous mesurez la teneur en eau de la cellule, et tout ce qui reste doit être « immobile », parqué à la surface des molécules de protéines et incapable de migrer en réponse à la pression osmotique. Cameron et al (1997) présentent le graphique (volé sans vergogne et affiché ici, à gauche) où la teneur en eau des cellules restantes est reportée sur un axe x de pression osmotique croissante. La ligne de la pression par rapport à l’eau restante, lorsqu’elle est extrapolée à partir des preuves expérimentales et étendue vers une pression osmotique « infinie », finit par croiser l’axe des y à un certain point non nul. Selon les cellules que vous utilisiez, cela finissait par représenter quelque part entre 30 et 90 % de la teneur totale en eau.

En fait, il semble que cette eau adsorbée sur les protéines soit l’eau essentielle des cellules, et que toute l’eau « libre » soit un lest inutile. Clegg (1981), en réhydratant des cellules de crevettes saumâtres séchées, a constaté que l’activité métabolique reprenait et était relativement normale lorsque les cellules étaient restaurées avec environ 35% d’eau en poids, c’est-à-dire à peu près autant que ce qui est attendu pour « hydrater » toutes les macromolécules. Dans ces crevettes, il est presque certain qu’il n’y avait pas d’eau libre en « phase de masse ». Certes, elles n’essayaient pas de se reproduire ou de synthétiser de l’ARN (ce qui nécessitait une hydratation de 70 à 80 %), mais la synthèse des acides aminés et les échanges gazeux se déroulaient relativement normalement. Cela rend d’autant plus remarquable le fait que, lorsqu’on le mesure objectivement, cette épaisse soupe à 20-30% de protéines a une viscosité qui ressemble beaucoup à celle de l’eau normale (Luby-Phelps, 1994)

Ph du fluide intracellulaire

Carter (1972) a publié un article très influent à ce sujet, qui est souvent cité dans les manuels de physiologie humaine, même si l’auteur a utilisé des muscles de la balane géante (Balanus nubilus) qu’il a mis en suspension dans quelque chose appelé « solution de Ringer de balane », une saumure contenant 450 mmol/L de sodium et 518 mmol/L de chlorure. On peut difficilement lire la suite avec un quelconque niveau de respect pour la généralisation humaine de telles données, mais si on le fait, on découvrirait la découverte la plus importante : que le pH dans les cellules est tellement compartimenté que différentes régions du cytosol avaient des valeurs de pH sauvagement différentes, dans une gamme de 6,0 à 7,5.

Concentrations d’électrolytes intracellulaires

Généralement, tous les manuels, lorsqu’on les interroge sur la concentration des électrolytes dans le fluide intracellulaire, produisent un Gamblegram comme celui-ci (détourné de Ling, 1984, sans autorisation de sa succession ou de son éditeur).

Ce diagramme ici n’est pas référencé dans le livre de Ling, mais on pourrait soutenir qu’il n’a pas à l’être, étant donné que Ling a effectué pratiquement tous les travaux révolutionnaires sur la détermination du comportement des solutés intracellulaires. Plus précisément, dans les années 1960, lui et Ochsenfeld ont déterminé que ce potassium (et tous les autres électrolytes du cytosol) n’est généralement pas présent sous une forme librement disponible, mais qu’il est plutôt adsorbé sur les structures macromoléculaires.

Les chercheurs ont soumis les cellules à des isotopes radiomarqués et ont constaté que cela avait peu d’effet sur le déplacement des électrolytes déjà présents là, ce qui aurait été attendu s’ils avaient été distribués librement. Les électrolytes intracellulaires sont en grande partie présents dans des complexes avec des macromolécules et sont beaucoup moins mobiles que ce que l’on pourrait attendre d’un modèle de cellule où tout le contenu existe dans un sac aqueux homogène. Les mêmes auteurs (Ling & Ochsenfeld, 1973) ont confirmé plus tard que la mobilité du potassium du compartiment intracellulaire au compartiment extracellulaire était approximativement un huitième de ce que l’on pourrait attendre d’une simple diffusion en solution libre. Les muscles de grenouilles tuées ont laissé fuir le potassium un peu plus facilement (le taux de diffusion n’a été réduit que de 25 % par rapport à ce qui était attendu), car les pompes alimentées par l’ATP ont cessé de fonctionner et la structure des protéines s’est désorganisée.

Alors, convenons que ces ions ne sont pas dissous dans un lac d’eau libre intracellulaire qui clapote, mais plutôt liés dans des complexes. Cela ne répond toujours pas à la question : quelle quantité de ce qui est là-dedans ? Il s’avère qu’il est relativement facile de répondre à cette question. Bien plus facile, en fait, que toutes les autres questions soulevées jusqu’ici dans ce chapitre. Il suffit de prendre son cytosol, de le lyophiliser, puis de mesurer la composition élémentaire de la masse sèche. Mason et al (1981) ont fait exactement cela pour certaines cellules tubulaires rénales, avant et après une blessure ischémique. Leurs résultats sont reproduits ci-dessous, à la fois sous la forme du tableau original de 1981 et d’un joli et brillant Gamblegram :

Comme on peut le voir d’après les fluctuations sauvages de la concentration de potassium après même 20 minutes d’ischémie, la composition électrolytique des cellules est beaucoup plus fluide que celle du liquide extracellulaire (où un changement de 20mmol dans la concentration de n’importe quel électrolyte serait mal toléré, à un niveau de survie existentielle de l’organisme). En outre, chaque lignée cellulaire présente une concentration ionique intracellulaire légèrement différente. D’où l’imprécision des valeurs d’électrolytes intracellulaires discutées dans les manuels et la réticence générale à citer des chiffres. Pratiquement tous les chiffres cités seront faux. Par exemple, les tubules distaux de Mason avaient 11mmol/L de sodium dans leur cytosol, mais Poole-Wilson (1975) a trouvé environ 44mmol/L dans les myocytes du ventricule gauche et 20mmol/L dans le quadriceps gauche. Alam et al (1977) donnent des valeurs d’environ 25 mmol/L pour le sodium et 145 mmol/L pour le potassium dans certaines cellules hépatiques défaillantes. En bref, l’environnement désordonné et imprévisible de toute cellule donnée rend difficile l’indication de chiffres précis.