Después del instituto, Fatone trabajó como artista en los Estudios Universal de Orlando, donde interpretó a «Wolfie» en el Rock and Roll Graveyard Revue de Beetlejuice.
NSYNC
En el verano de 1995, después de hacerse amigo de Chris Kirkpatrick, un compañero de escenario de los Estudios Universal que cantaba en un grupo de doo-wop, se convirtió en el cuarto miembro de NSYNC, junto con Justin Timberlake y JC Chasez. Luego se añadió Lance Bass al grupo que se convertiría en NSYNC. En 2001, Fatone coprotagonizó con su compañero de banda de *NSYNC, Lance Bass, la película de Miramax On the Line, actuó como invitado con NSYNC en un episodio de 2001 de The Simpsons, New Kids on the Blecch, y también hizo trabajos de voz con Bass en los mismos episodios de Kim Possible de Disney y Robot Chicken de Adult Swim.
Carrera posterior a NSYNC
Fatone coprotagonizó la película de comedia dramática de 2002 Mi gran boda griega como Angelo, el primo de Toula, apareció en la serie Mi gran vida griega y volvió a interpretar el papel en la secuela de 2016 Mi gran boda griega 2. Actuó en la película aclamada por la crítica The Cooler. Ha tenido papeles menores en la película experimental Red Riding Hood y Homie Spumoni, esta última junto a Jamie-Lynn Sigler. Fatone también ha actuado en Broadway, interpretando papeles principales en Rent en 2002 y en una reposición de Little Shop Of Horrors.
Fatone presentó el programa The Singing Bee de la NBC, así como la versión australiana del programa en Nine Network. El 21 de agosto de 2007, se anunció que, junto con Lisa Rinna, sustituiría a Joan Rivers y Melissa Rivers como presentadores de la alfombra roja de TV Guide para la temporada 2007-2008. En 2005, la NBC contrató a Fatone como presentador (o «maestro de ceremonias») de su serie de telerrealidad Celebrity Circus. Ese año, también actuó como invitado en el episodio de Hannah Montana «Bye Bye Ball» como el dueño del restaurante Joey Vitolo, un ex jugador de béisbol que obliga a Hannah a cantar a cambio de una pelota firmada de repuesto para su hermano. Fatone pasó a representar a otro jugador de béisbol en la serie de Disney Channel Imagination Movers en 2010. Del 6 al 18 de julio de ese mismo año, también actuó en el musical «The Producers» en el Benedum Center de Pittsburgh en el papel del cómico soldado nazi Franz Liebkind.
Fatone ha prestado su voz a varios episodios de Robot Chicken, protagonizando él mismo un sketch de kung fu llamado «Enter the Fat One» y teniendo un cameo vocal en el episodio de Star Wars del programa. De 2010 a 2015, Fatone fue el presentador de Steve Harvey en el programa Family Feud. En 2011, aceptó un trabajo como anfitrión de la serie de Live Well Network My Family Recipe Rocks. En octubre del mismo año, también apareció en la película de terror Inkubus.
En enero de 2012, fue una de las ocho celebridades que participaron en el reality de Food Network Rachael vs. Guy: Celebrity Cook-Off. Aunque fue eliminado en la sexta semana, consiguió un premio de 5.000 dólares para su organización benéfica, la Fatone Family Foundation.
Apareció como celebridad invitada en el programa The Price Is Right Live! en Bally’s Las Vegas. Fatone también fue invitado en la segunda temporada del programa The Eric Andre Show de Adult Swim. De mayo a junio de 2013, interpretó a Bert en la producción de la CLO de Pittsburgh de 42nd Street.
Fatone hizo un cameo en febrero de 2014 en el programa de cámara oculta Impractical Jokers, sustituyendo a una de las estrellas del programa, Brian Quinn, durante un desafío. Más tarde apareció como invitado en un episodio de 2017, habiendo dado permiso para filmar en su restaurante de perritos calientes de Orlando, Fat One’s. Desde 2016, ha sido el anfitrión o invitado principal en especiales como «Nitro Circus Spectacular», «The Joker Games» y «Fantasy Draft». Ha sido el presentador permanente de la serie derivada Impractical Jokers: After Party desde su estreno en 2017. Su relación con las estrellas del programa también le valió un cameo en la película de 2020 Impractical Jokers: The Movie.
En abril de 2014, Fatone comenzó a presentar el concurso de cocina Rewrapped de Food Network, en el que los chefs deben recrear comidas clásicas de aperitivos y luego crear nuevos platos con dichos aperitivos. En agosto del mismo año, Fatone se convirtió en el anfitrión de otra serie, Parents Just Don’t Understand, que se emitió en Hub Network antes de su cambio de marca a Discovery Family. También actuó como invitado en tres episodios de The Jack and Triumph Show en 2015.
En 2019, Fatone interpretó al Conejo en la primera temporada del programa de competición de canto The Masked Singer, empatando con Rumer Willis en el cuarto puesto de la clasificación general. Actualmente es el presentador de Common Knowledge, un programa de juegos que se estrenó el 14 de enero de 2019 en Game Show Network.