Indhold og egenskaber af intracellulær væske

Dette kapitel er vagt relevant for afsnit E(iv) i 2017 CICM Primary Syllabus, som forventer, at eksaminanden skal “beskrive sammensætningen …af intracellulær væske”. Da dette er afsnittet om cellefysiologi, vil fokus her hovedsageligt være på mikroorganisationsniveauet, og al diskussion af det intracellulære kropsvæskekompartment vil blive overladt til afsnittet om kropsvæsker.

Den kendsgerning, at eksaminatorerne på college aldrig har fokuseret deres øje på dette emne, giver en næsten befriende luft af meningsløshed til diskussionen af det, da både eksaminanderne og forfatteren er behageligt klar over, at de hver især spilder den andens tid. I stedet for at indsnuse hård videnskab og lære eksamensrelevante fakta udenad kan man sagtens læse videre af rent medutainmentmæssige årsager eller springe videre til emner, der giver flere point.

Sammenfattende:

Hvad er de gyldige peer-reviewede ressourcer til dette emne? Desværre er de mange. Når man bruger en søgemaskine eller indeksafsnittet i en lærebog til at slå op på “intracellulær væske”, er der uundgåeligt et svar, en række poster eller sider eller powerpoint-slides, som – selv om de alle er vagt ens i deres indhold – adskiller sig fra hinanden i deres citerede værdier, og som ikke tilbyder noget i form af referencer. Mange af dem indeholder ingen nyttige oplysninger overhovedet. Hvis man f.eks. vender sig mod de officielle universitetsbøger om dette emne (Ganong, s. 2 i den 23. udgave, og Guyton & Hall, s. 4 i den 13. udgave), finder man f.eks. cytosoliske elektrolytkoncentrationer, der diskuteres med udtryk som “store mængder”. Selv uden for den officielle bibliografi har ellers solide værker som Molecular Biology of the Cell ikke ligefrem svar. De kan ikke engang blive enige om, hvad de skal kalde det (cytosol? Protoplasma? Primordialschlauch?)

Glædeligvis er der stadig videnskabsmænd derude, der udgiver om dette emne. Den bedste artikel er nok artiklen fra 1999 af Katherine Luby-Phelps, som stort set indeholder alt, hvad du kan få brug for til at besvare eventuelle hypotetiske fremtidige SAQ’er om dette emne. Et andet glimrende indlæg, der primært omhandler egenskaberne ved det intracellulære materiale, er den korte artikel af Richard P. Sear (2005). Hvis man virkelig er gal og har tidsressourcer som en fast ansat specialist (dvs. ingen presserende forpligtelse til rent faktisk at udføre noget nyttigt arbejde), kan man i stedet undersøge Gilbert Lings In Search of the Physical Basis of Life (1984), en 800 sider lang bog skrevet af en mand, hvis publikationer om cellefysiologi strækker sig helt tilbage til 1950’erne.

Volumen af et intracellulært rum

Hvor stor er en celle? Det afhænger naturligvis af cellen. Et godt eksempel på en udbryder er Xenopus-oocytten, ægget fra en afrikansk tudse med kløer, som er 1 mm i diameter. Når man taler om mennesker, taler man normalt om intracellulær væske, som om der er tale om en relativt homogen spand, men i virkeligheden består dette væskekompartment af noget i retning af 1014 minikompartmenter, som hver især har et lidt forskelligt volumen og sammensætning.

Heterogeniteten af alle disse volumener er godt opsummeret i dette kapitel i BioNumbers-databasen, hvor man kan finde alle mulige omhyggeligt refererede oplysninger. Det gengives her med minimale ændringer, i tilfælde af at Harvard-serverne nogensinde skulle gå ned.

Volumener af pattedyrceller

Celletype	Volumen (μm3, eller femtoliter)	Volumen (picoliter)	Reference
Spermcelle	30	0.03	Gilmore et al, 1995
Erythrocyt	100	0.1	Ballas et al, 1987
Lymphocyt	130	0,13	Schmid-Schonbein et al, 1980
Neutrofil	300	0.3	Rosengren et al, 1994
Pancreatisk β-celle	1,000	1.0	Finegood et al, 1995
Enterocyt	1,400	1,4	Wiśniewski et al, 2012
Fibroblast	2,000	2.0	Mitsui et al, 1976
Cervikal tumor (HeLa)	3.000	3.0	Zhao et al, 2008
Hårcelle (øre)	4.000	4.000	4.0	Géléoc et al, 1999
Osteoblast	4,000	4.0	Beck et al, 2011
Alveolær makrofag	5,000	5.0	Krombach et al, 1997
Cardiomyocyt	15.000	15.0	Calvillo et al, 2003
Megakaryocyt	30.000	30.0	Harker et al, 2000
Adipocyt	60.000	60.0	Livingston et al, 1984
Oocyte	4.000.000.000	4000	Goyanes et al, 1990

Så det er et ret bredt spektrum. Desuden vil naturligvis ikke hele cellens indhold være optaget af “intracellulær væske”, uanset hvad din definition af dette begreb er. I dette kapitel vil definitionen af intracellulær væske f.eks. være “intracellulært indhold, som ikke er organeller”, alene af den grund, at organellerne behandles i et andet kapitel. Det, vi i så fald taler om, er den “grålige, tyktflydende, slimede, halvtransparente og halvflydende substans”, som optager det intracellulære rum mellem andre strukturer (Harvey, 1937).

Afhængigt af hvilken slags celle, man ser på, kan dette rum være en meget lille del af det samlede volumen. F.eks. vil det store flertal af de 60 picoliter af det samlede volumen i den omentale adipocyt, der er nævnt ovenfor, være optaget af vandløst fedt. Dette kan bevises eksperimentelt: DiGirolamo & Owens (1976) kunne beregne, at vandvolumenet i rotte adipocytter var ca. 5-7% af det samlede volumen, dvs. 1,5-2 picoliter.

Kort sagt, vi har at gøre med et meget lille volumen. Hvorfor har det nogen betydning? Jo. Cellens indre væskevolumen på 1-2 picoliter væskevolumen er fordelingsvolumenet for opløselige stoffer. Molekylerne af disse stoffer har derfor en meget kort afstand at tilbagelægge, før de møder hinanden. Virkningen er, at reaktionshastigheden øges, hvilket er nyttigt, fordi den samlede mængde reagensmolekyler for et så lille volumen nødvendigvis er lille. For at låne et eksempel fra Luby-Phelps (2000): Hvis en celle har et samlet indhold på 1 nanomol af et protein, betyder det, at der kun er 1000 kopier af dette protein til stede i cellen. Heldigvis vil et bindingsmolekyle med en så lille volumen, der skal gennemløbes, selv med en lav affinitet være i stand til at skrubbe op og adsorbere størstedelen af det tilgængelige substrat.

Proteinindholdet i den intracellulære væske

Okay, så volumenet er lille. Hvilke makromolekyler er der i den, og hvor mange er der af dem? Alice B. Fulton (1982) har givet et svar på dette spørgsmål med det nok mest klare svar i den offentliggjorte litteratur. Grundlæggende ligger proteinindholdet i celler i intervallet 17 til 35 vægtprocent, og de fleste forfattere ligger i intervallet et sted mellem 20-30 g/100 ml. Fulton citerer gamle tekster (Loewy et al., 1969) for at give følgende værdier:

• Muskelceller: 23 vægtprocent protein
• Erythrocytter: 35% protein pr. vægt
• De fleste andre celler: 17% til 26% protein pr. vægt

Målingerne foretages normalt ved hjælp af brydningsindeksmålinger, hvilket er en teknik, der normalt ikke skelner mellem strukturelle proteiner (f.eks. dem, som cytoskelettet og organellerne består af) og opløselige proteiner, som udgør resten af goo.

Så, hvad er pointen med denne diskussion? Tja. Denne koncentration af protein er ret høj. Den ligger over den normalt accepterede koncentration af store polymerer, som man ville forvente ville påvirke diffusionen af andre lignende polymerer, dvs. skoven er for tæt. Chang et al (1987) har udarbejdet en matematisk model, som forudsiger, at for polymerer på 50 kDa og derover ligger diffusionsgrænsen på ca. 130 g/L, dvs. at hvis der er mere end det, vil andre polymerer ikke være i stand til at diffundere let gennem opløsningen. De brugte ganske vist polystyren opløst i benzen, men faktum er, at det ikke desto mindre er tilfældet. Til sammenligning, når man fuldt ud krystalliserer et protein, ender man med et “fast stof”, som kun består af 40% protein i vægt

Sammenfattende er proteinerne i den intracellulære væske pakket så tæt sammen, at cytosolen må betegnes som en “overfyldt opløsning”. Det tegneserieagtige diagram her (oprindeligt offentliggjort af Goodsell i 1993 og efterfølgende gengivet af stort set alle, der nogensinde har skrevet om cytosol) viser visuelt præcis, hvor tæt pakket disse legemer er. Tegningen blev tilnærmet ved hjælp af kendte størrelser og former af molekyler/elektronmikroskop, men billeder taget gennem SEM (f.eks. af Bridgman & Reese, 1984) viser, at den korrekt repræsenterer den rodet mikrostruktur i cytosolen. Når man ser på Xenopus oocytter ved en forstørrelse på ~ 80.000, bliver en tæt skov af filamenter og granula tydelig. Billedet her (en del af deres figur 6) blev faktisk renset en smule op ved cellelysis og vask med detergent for at fjerne noget af den proteinbelastning, der ellers skjulte den finere struktur. Pilene peger på filamenternes Y- og T-knudepunkter.

Suden detergentpræparering bliver alt det fine granulære materiale, der er pakket ind mellem disse filamenter, synligt. Billedet ligner nu hvid støj (samme forfattere).

Det er klart, at diffusion gennem dette tyktæppe ikke vil være normal. Mindre opløsningsstoffer (f.eks. dine natrium- og kaliumioner) er nødt til at navigere rundt om disse enorme forhindringer og tage den naturskønne vej mod hinanden. Ud fra et praktisk synspunkt bør dette betyde, at enhver reaktion, der afhænger af diffusionshastigheden, vil være langsommere. Hvis molekyler tager en evighed om at nå frem til hinanden, bør nettosatsen for deres interaktion helt sikkert blive reduceret. Men det ser vi ikke.

Hvilke kemiske egenskaber ser vi, med denne stærkt mættede proteinsuppe? Allen P. Minton (2006) har sammenfattet flere års (hovedsageligt hans egen) forskning i en tabel i den ovenfor refererede artikel. Den er opsummeret her:

• Forbedret bindingsaffinitet af ellers fortyndede makromolekyler for hinanden
• Acceleration af proteinforbindelser f.eks. selvassemblering
• Afbremsning af diffusionsbegrænsede reaktioner og proteinassociationer
• Stabilisering af proteiner mod denaturering ved varme

Sammenfattende tvinger crowding proteiner til at folde sig og interagere, hvilket giver komplekse konfigurationer, som ellers ville være umulige i en fortyndet opløsning. F.eks. opdagede Wilf & Minton i 1981, at fortyndede myoglobinmolekyler i opløsning har ringe interesse for hinanden, men tilsætning af en 10 % opløsning af (et hvilket som helst!) andet protein får myoglobinet til spontant at samle sig til dimerer.

Egenskaberne ved intracellulært vand

Selv i et krystalliseret protein er kun 40% af massen egentligt protein. Resten er opløsningsmiddel, som optager mellemrummene mellem de pakkede proteinmolekyler (de er ikke helt rektangulære og ligger ikke pænt oven på hinanden). Når opløsningsmidlet er vand, ender halvdelen af det med at blive adsorberet på proteinets overflade, men resten kan stadig betragtes som normalt flydende vand. I denne tynde film er ionerne i det intracellulære vand opløst.

Det er klart, at med det bundet adsorberede vand er tingene lidt anderledes. For eksempel vil opløsningsmiddelegenskaberne for dette vand ikke være nøjagtigt de samme som for “frit” vand. For det første vil det sandsynligvis have reduceret kemisk aktivitet. Som man kunne forvente, giver vandets “ordnede” tilstand det flere usædvanlige kolligative egenskaber – f.eks. fandt Foster et al (1976), at dets frysepunkt er sænket. Desuden vil der være lommer af cytosol med øget aktivitet (omkring de hydrofile proteinstrukturer) og nedsat aktivitet (omkring de hydrofobiske).

Hvor stor en del af vandet holdes i denne fangenskabstilstand af proteinerne? Det er noget vanskeligt at sige. Eksperimenter af Ling et al (1993) tyder på, at inde i cellerne er det meste af vandet “ordnet” på denne måde, men de fleste eksperimenter, der rapporterer om dette emne, er noget påvirket af, at de rå levende celler, de bruger, har forskellige homøostatiske reaktioner på de eksperimentelle betingelser, som forvirrer resultaterne.

Sædvanligvis forsøger man at fastslå dette svar ved at dehydrere cellerne osmotisk. Påfør et osmotisk tryk, ræsonnerer de, og alt det “mobile” vand skulle komme ud af cellen. Derefter måler man cellens vandindhold, og alt det, der er tilbage, må være “immobilt”, parkeret på overfladen af proteinmolekyler og ude af stand til at vandre som reaktion på det osmotiske tryk. Cameron et al (1997) præsenterer grafen (stjålet skamløst og vist her til venstre), hvor vandindholdet i de resterende celler er plottet op mod en x-akse med stigende osmotisk tryk. Når linjen for tryk vs. resterende vand ekstrapoleres ud fra eksperimentelle beviser og forlænges i retning af et “uendeligt” osmotisk tryk, ender den med at krydse y-aksen i et punkt, der ikke er nul. Afhængigt af hvilke celler man brugte, endte det med at være et sted mellem 30-90% af det samlede vandindhold.

Det ser faktisk ud til, at dette vand, der er adsorberet på proteiner, er det essentielle vand i cellerne, og alt det “frie” vand er meningsløs ballast. Clegg (1981), der rehydrerede nogle tørrede saltvandsrejeceller, fandt, at den metaboliske aktivitet blev genoptaget og var relativt normal, når cellerne blev genoprettet med ca. 35 vægtprocent vand. dvs. ca. så meget som det forventes at “hydrere” alle makromolekylerne. I disse rejer var der næsten helt sikkert ikke noget frit vand i “bulkfasen” til stede. De forsøgte ganske vist ikke at reproducere sig eller syntetisere RNA (hvilket krævede hydrering på op til 70-80 %), men deres syntese af aminosyrer og gasudveksling foregik relativt normalt. Dette gør det så meget desto mere bemærkelsesværdigt, at når man måler objektivt, har denne tykke 20-30% proteinsuppe en viskositet, der minder meget om normalt vand (Luby-Phelps, 1994)

Intracellulær væske pH

Carter (1972) udgav en meget indflydelsesrig artikel om dette, som ofte citeres i lærebøger i humanfysiologi, selv om forfatteren brugte muskler fra kæmpebarnevognen (Balanus nubilus), som han suspenderede i noget, der kaldes “Barnacle Ringer’s Solution”, en saltvand med 450 mmol/L natrium og 518 mmol/L klorid i den. Man kan næppe læse videre med nogen respekt for den menneskelige generaliserbarhed af sådanne data, men hvis man gør det, vil man opdage det vigtigste resultat: at pH-værdien i cellerne er så meget opdelt, at forskellige områder af cytosolen havde vildt forskellige pH-værdier, i et interval på 6,0 til 7,5.

Intracellulære elektrolytkoncentrationer

Generelt set vil alle lærebøger, når man spørger om koncentrationen af elektrolytter i den intracellulære væske, producere et Gamblegram som dette (misbrugt fra Ling, 1984, uden tilladelse fra hans bo eller hans forlag).

Dette diagram her er ikke refereret i Lings bog, men man kan hævde, at det behøver det ikke at være, når man tager i betragtning, at Ling har udført stort set alt det banebrydende arbejde med at bestemme intracellulære opløststoffers adfærd. Konkret fastslog han og Ochsenfeld i 1960’erne, at dette kalium (og alle de andre elektrolytter i cytosolen) generelt ikke er til stede i frit tilgængelig form, men i stedet er adsorberet på de makromolekylære strukturer.

Undersøgerne udfordrede cellerne med radioaktivt mærkede isotoper og fandt, at dette kun havde ringe effekt på fortrængningen af de elektrolytter, der allerede var til stede der, hvilket ville have været forventet, hvis de havde været frit fordelt. De intracellulære elektrolytter er i høj grad til stede i komplekser med makromolekyler og er langt mindre mobile, end man kunne forvente ud fra en model af en celle, hvor alt indholdet eksisterer i en homogen vandig sæk. De samme forfattere (Ling & Ochsenfeld, 1973) bekræftede senere, at mobiliteten af kalium fra det intracellulære til det ekstracellulære rum var ca. en ottendedel af, hvad man kunne forvente af simpel diffusion i fri opløsning. Afdøde frømuskler lækkede kalium noget lettere (diffusionshastigheden blev kun reduceret med 25 % i forhold til den forventede), da ATP-drevne pumper holdt op med at fungere, og proteinstrukturen blev desorganiseret.

Så lad os blive enige om, at disse ioner ikke er opløst i en skvulpende sø af frit intracellulært vand, men snarere er bundet i komplekser. Det giver stadig ikke svar på spørgsmålet: Hvor meget af hvad er der i dem? Det viser sig, at det er relativt nemt at besvare. Faktisk meget nemmere end nogen af de andre spørgsmål, der er blevet rejst indtil videre i dette kapitel. Man skal blot tage sin cytosol, frysetørre den og derefter måle grundstofsammensætningen af den tørre masse. Mason et al (1981) gjorde netop dette for nogle nyretubulære celler, før og efter iskæmisk skade. Deres resultater er gengivet nedenfor, både i form af den originale tabel fra 1981 og et flot skinnende Gamblegram:

Som man kan se af de vilde udsving i kaliumkoncentrationen efter selv 20 minutters iskæmi, er cellernes elektrolytsammensætning meget mere flydende end den ekstracellulære væskes (hvor en ændring på 20 mmol i koncentrationen af en hvilken som helst elektrolyt ville blive dårligt tolereret, på et eksistentielt overlevelsesniveau for organismen). Hertil kommer, at hver cellelinie vil have en lidt anderledes intracellulær ionkoncentration. Dette er årsagen til, at de intracellulære elektrolytværdier, der diskuteres i lærebøgerne, er upræcise, og at de generelt er tilbageholdende med at angive nogen tal. Stort set alle de tal, man angiver, vil være forkerte. F.eks. havde Masons distale tubuli 11 mmol/L natrium i deres cytosol, men Poole-Wilson (1975) fandt ca. 44 mmol/L i venstre ventrikels myocytter og 20 mmol/L i venstre quadriceps. Alam et al (1977) angiver værdier på ca. 25 mmol/L for natrium og 145 mmol/L for kalium i nogle svigtende leverceller. Kort sagt, det rodet og uforudsigelige miljø i en given celle gør det vanskeligt at angive specifikke tal.