Strains of Streptococcus pyogenes from Severe Invasive Infections Bind HEp2 and HaCaT Cells More Avidly than Strains from Uncomplicated Infections

Streptococcus pyogenes (paciorkowiec grupy A) jest czynnikiem etiologicznym różnych chorób ludzkich, w tym zapalenia gardła, piodermii i ciężkich chorób inwazyjnych. Ponadto, patogen ten jest związany z potencjalnie zagrażającymi życiu następstwami, takimi jak poststreptokokowe kłębuszkowe zapalenie nerek i ostra gorączka reumatyczna. Na Terytorium Północnym (NT) w Australii częstość występowania ostrej gorączki reumatycznej jest bardzo wysoka wśród rdzennej ludności (3), pomimo niskiego wskaźnika izolacji GAS z gardła. Ponadto, piodermia wywołana zakażeniem GAS jest niezwykle powszechna, a poststreptokokowe kłębuszkowe zapalenie nerek jest endemiczne w wielu odległych społecznościach aborygeńskich (4, 7). Podczas gdy bezobjawowe nosicielstwo w gardle jest często zgłaszanym rezerwuarem dla szczepów związanych z chorobą inwazyjną (5), w populacjach, w których liszajec jest chorobą endemiczną, jak np. w społecznościach aborygeńskich w NT, podstawowym rezerwuarem jest skóra. Niezależnie od tego, która tkanka jest pierwotnym miejscem zakażenia, pierwszym wydarzeniem, jakie musi osiągnąć patogen jest przyleganie do komórek gospodarza. Genom S. pyogenes koduje liczne geny, które można uznać za kodujące adhezyny. Geny te są wysoce regulowane, a poszczególne szczepy nie mają potencjału genetycznego do kodowania wszystkich tych białek. Do adhezyn należą: białko M (cząsteczka antyfagocytarna), kapsułka oraz białka wiążące fibronektynę. Istnieje wiele różnych białek wiążących fibronektynę, takich jak SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2) i SfbII (11). Zdolność adherencji poszczególnych szczepów może się różnić w zależności od repertuaru genów dla adhezyn posiadanych przez dany szczep i poziomu ich ekspresji. To z kolei może odzwierciedlać różnice w zdolności do kolonizacji i trwałego zakażania różnych miejsc w tkankach. Konsekwencją tego jest fakt, że izolaty pochodzące z różnych miejsc w tkankach mogą wykazywać różnice w zdolności do adherencji. Aby to sprawdzić, określiliśmy stopień wiązania izolatów GAS ze skóry, gardła i krwi do linii komórkowych HEp2 i HaCaT, reprezentujących odpowiednio ludzkie komórki nabłonka krtani i keratynocyty.

Izolaty GAS z NT zostały zebrane w latach 1990-2002. 72 szczepy analizowane w tym badaniu zostały wyizolowane z krwi (n = 26), skóry (n = 22) i gardła (n = 24) (Tabela 1). Izolaty z krwi pochodziły z ciężkich chorób, a pozostałe szczepy z niepowikłanych zakażeń. Izolaty poddano typowaniu Vir w sposób opisany wcześniej (6). Typowanie Vir polega na polimorfizmie długości fragmentów restrykcyjnych regulonu mga, który zawiera gen dla wysoce zmiennego białka M. Aby zapewnić włączenie szczepów epidemiologicznie niepowiązanych, włączono po jednym reprezentatywnym izolacie z każdego typu Vir. Hodowle hodowano przez noc w temperaturze 37°C w wytrząsarce orbitalnej do fazy stacjonarnej w bulionie Todd-Hewitta (Oxoid, Basingstoke, Wielka Brytania) uzupełnionym 1% ekstraktem drożdżowym. W celu przygotowania inokulum GAS do testów adherencji, całonocne hodowle odwirowywano, a osady płukano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) i ponownie zawieszano w pozbawionej surowicy i antybiotyków pożywce RPMI 1640 (Life Technologies) do uzyskania gęstości optycznej przy 600 nm równej 0,05. Odpowiada to w przybliżeniu 1 × 107 do 1,5 × 107 bakterii na ml.

Ludzkie komórki nabłonka krtani (HEp2) były utrzymywane w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą (Life Technologies), 1% Fungizone (Life Technologies), 20 μg wankomycyny HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Australia) na ml, i 100 μg siarczanu streptomycyny (Sigma, St. Louis, Mo.) na ml. Ludzkie dorosłe keratynocyty skóry (komórki HaCaT) hodowano w podłożu Dulbecco’s modified Eagle (Life Technologies) uzupełnionym 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą. W celu oceny adherencji, ∼105 komórek/ml wysiewano na szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w dnie 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (Nunc, Roskilde, Dania). Po całonocnym wzroście w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2, komórki przemywano PBS (pH 7,4) i inokulowano 500 μl inokulum GAS. Po 2 h inkubacji w temp. 37°C, szkiełka nakrywkowe przemywano pięciokrotnie dodając 1 ml PBS do każdej studzienki, a po delikatnym wymieszaniu roztwór przemywania usuwano przez aspirację. Po usunięciu nieprzylegających bakterii, komórki gospodarza i przylegające bakterie zostały utrwalone 95% metanolem i wysuszone na powietrzu. Po utrwaleniu termicznym, szkiełka nakrywkowe umieszczano na szkiełkach mikroskopowych i barwiono metodą Grama do oglądania w zanurzeniu olejowym. W każdym eksperymencie analizowano komórki w kilku losowo wybranych polach, a przyleganie wyrażano jako średnią liczbę łańcuchów GAS na komórkę. Wszystkie testy przeprowadzono w dwóch egzemplarzach, a dla każdego szczepu określono średnią wartość wiązania. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programu Stata Statistics/Data Analysis w wersji 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). Dane analizowano za pomocą testów t.

Szczepy GAS przylegały do obu typów komórek, a stopień wiązania różnił się w zależności od szczepu (Tabela 1). Stwierdzono dobrą korelację między niezależnymi eksperymentami z 20 izolatami powtarzanymi w dwóch odstępach czasu (dane nie pokazane), co sugeruje, że awidność wiązania jest powtarzalna i specyficzna dla danego szczepu. Ogólnie rzecz biorąc, wiązanie GAS do komórek HaCaT jest większe niż do komórek HEp2 (P < 0,05). Gdy dane w Tabeli 1 zostały rozdzielone na podstawie miejsca izolacji tkanki, średnio 270 łańcuchów szczepów GAS z krwi wiązało się z 50 komórkami HaCaT (ryc. 1). Natomiast izolaty ze skóry i gardła wiązały średnio tylko 169 i 178 łańcuchów na 50 komórek HaCaT, odpowiednio. Różnice te są statystycznie istotne (P = 0,0044 i 0,0063, odpowiednio). Co ciekawe, w przypadku komórek HEp2 różnice te są mniej wyraźne i nieistotne statystycznie. Jednakże, gdy dane zostały ponownie przeanalizowane w oparciu o inwazyjne versus niepowikłane infekcje poprzez połączenie danych dla izolatów skóry i gardła, znaczące różnice między tymi dwiema kategoriami zostały znalezione w obu liniach komórkowych (P = 0.0011 dla HaCaT; P = 0.0238 dla HEp2).

Wcześniejsza praca z tego laboratorium wykazała, że wiele powszechnie krążących szczepów S. pyogenes może powodować inwazyjną chorobę ze skórą jako pierwotnym miejscem infekcji (1). Obserwacje te są zgodne z obecnymi ustaleniami dotyczącymi wyższej awidności szczepów NT GAS do linii komórkowych HaCaT niż HEp2 oraz izolatów krwi zdolnych do wiązania się w większej liczbie niż izolaty z niepowikłanych infekcji. Możliwe wyjaśnienie wysokiej skłonności do adherencji izolatów S. pyogenes z krwi obejmuje zarówno różnice genotypowe, jak i fenotypowe pomiędzy izolatami pochodzącymi z inwazyjnych i nieinwazyjnych źródeł choroby. Wymagane są dalsze badania w celu określenia charakteru tej awersji wiązania i ustalenia, czy jest ona spójna w obrębie populacji klonalnych.