Materials and Methods
Participants
Subjects were 83 children with ADHD (75% males) and 72 TD children (51% males), aged between 6 and 13 years. Kryteria włączenia do grupy ADHD obejmowały: (a) kliniczne rozpoznanie ADHD według kryteriów DSM-IV, (b) potwierdzenie tego rozpoznania za pomocą Diagnostic Interview Schedule for Children, fourth edition, podawanego rodzicom (DISC-IV-P; ), (c) znaczące objawy ADHD, jak wskazano w ocenach rodziców >90 percentyla na co najmniej jednej ze skal ADHD (skala nieuwagi i nadpobudliwości/impulsywności) Skali Oceny Zaburzeń Zachowania (DBDRS; ), i (d) wszechobecne objawy ADHD, jak wskazano w ocenach nauczycieli >75 percentyla na co najmniej jednej ze skal ADHD DBDRS. Posiadanie diagnozy współwystępującej (np. ODD lub ASD) nie było kryterium wykluczenia, podobnie jak leczenie lekami stymulującymi. Dzieci przyjmujące leki stymulujące (N = 50, 60% grupy ADHD) zaprzestały ich przyjmowania na 24 godziny przed badaniem, aby umożliwić całkowite wypłukanie leku, oraz podczas udziału w badaniu. Kryteria włączenia do grupy TD były następujące: (a) brak klinicznej diagnozy jakiegokolwiek zaburzenia rozwojowego lub behawioralnego (w tym ADHD i ODD), oraz (b) wyniki <90. percentyla w obu ocenianych przez rodziców i nauczycieli skalach ADHD DBDRS.
Materiały
Zachowanie.
Rodzice dzieci kwalifikujących się do włączenia do grupy ADHD zostali ocenieni za pomocą sekcji zaburzeń zachowania DISC-IV-P. DISC-IV-P jest szeroko stosowanym standaryzowanym wywiadem diagnostycznym do oceny dziecięcych zaburzeń psychicznych DSM-IV, o odpowiednich właściwościach psychometrycznych .
Rodzice i nauczyciele dzieci zarówno w grupie ADHD, jak i TD wypełnili DBDRS w celu oceny objawów ADHD oraz objawów ODD i CD. DBDRS zawiera cztery skale mierzące objawy nieuwagi, nadpobudliwości/impulsywności, ODD i CD na 4-punktowej skali Likerta (w zakresie od 0 do 3), przy czym wyższe wyniki wskazują na gorsze objawy. Strengths and Weaknesses of ADHD-symptoms and Normal Behaviour rating scale (SWAN; ) był wypełniany przez rodziców i nauczycieli w celu oceny objawów ADHD. Ten szeroko stosowany kwestionariusz zawiera dwie podskale: Skalę Nieuwagi i Skalę Nadpobudliwości/Impulsywności, z których każda składa się z 9 pozycji. Pozycje są oceniane na 7-punktowej skali Likerta (w zakresie od -3 do +3), przy czym wyższe wyniki wskazują na gorsze objawy. Pozycje oparte są na objawach ADHD wg DSM-IV, ale odzwierciedlają oba końce (silny i słaby) zachowań opisanych w każdym z objawów ADHD. Średnie wyniki w obu podskalach zostały użyte jako zmienne zależne. Odpowiednie właściwości psychometryczne zostały zgłoszone dla SWAN .
Objawy ADHD zostały ocenione przy użyciu 65-itemowej Skali Reagowania Społecznego (SRS; ), wypełnianej przez rodziców i nauczycieli. Pozycje SRS są oparte na domenach objawów DSM-IV ASD, w tym upośledzeniu interakcji społecznych, deficytach komunikacyjnych i ograniczonych/stereotypowych wzorcach zachowań lub zainteresowań. W SRS zastosowano 4-punktową skalę Likerta (od 0 do 3), a jako miarę zależną wykorzystano zsumowany wynik pozycji w całkowitej skali SRS, przy czym wyższe wyniki wskazywały na gorsze objawy. SRS ma odpowiednie właściwości psychometryczne .
Punkty krwi.
Do zbadania stężenia tryptofanu, tyrozyny i fenyloalaniny we krwi zastosowano technikę suszonych punktów krwi. Pobieranie plamek krwi jest mniej inwazyjne dla dzieci niż pobieranie próbek krwi żylnej, a technika suszonych plamek krwi jest wystarczająco solidna i stabilna do celów diagnostycznych. Stężenia AAA w plamkach krwi są wysoce skorelowane ze stężeniami AAA w surowicy (rs od .86 do .96) . U każdego dziecka pobrano plamkę krwi za pomocą jednorazowego lancetu bezpiecznego. Trzy krople krwi zostały naniesione na kartę do barwienia krwi. 5,5 mm nakłuwacz z wysuszonej plamki krwi został zmieszany ze 100μl roztworu wzorca wewnętrznego (zawierającego 29μM L-fenyloalaniny-D5, 6μM L-tyrozyny-D4 i 5μM L-tryptofanu-D5) i 400μl metanolu w fiolce do chromatografii gazowej (GC-vial) i wytrząsany przez 15 minut w łaźni ultradźwiękowej. Supernatant został przeniesiony do innej fiolki GC i odparowany pod azotem w temperaturze 30°C. Następnie próbkę poddano butylowaniu za pomocą 100μl 5,5% chlorku acetylu (w n-butanolu) w temperaturze 60°C przez 15 minut. Po tym czasie warstwę butanolu odparowano pod azotem (w temp. 30°C), a pozostałość rozpuszczono w 500μl acetonitrylu. Stężenia tryptofanu, tyrozyny i fenyloalaniny w plamkach krwi oznaczano metodą chromatografii cieczowej z dodatnim elektrosprayem i tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS), przy użyciu spektrometru mas API 3000 triple quadrupole (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), sprzężonego z systemem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (Perkin Elmer Series 200, Shelton, USA). Trzy μl próbki nastrzykiwano na kolumnę Symmetry C18 (3,9*150mm, 5μm; Waters, Milford, MA, USA) i eluowano z szybkością przepływu 1ml/min 75% acetonitrylem (zawierającym 0,4% kwasu mrówkowego). Tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina eluowały w ciągu 1 minuty i były mierzone przy użyciu przejść: stosunek masy do ładunku (m/z) 261,2→159,2 (tryptofan), m/z 238,2→136,2 (tyrozyna) i m/z 222,2→120,2 (fenyloalanina). Wszystkie uzyskane dane LC-MS/MS były pozyskiwane i przetwarzane przy użyciu oprogramowania Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Stężenia tryptofanu, tyrozyny i fenyloalaniny w plamkach krwi wyrażono w μmole/L. Wiarygodność LC-MS/MS została potwierdzona przez zbadanie wariancji międzypróbkowej (wynoszącej 5-10%), wariancji wewnątrzpróbkowej (wynoszącej 8-10%) i odzysku (wynoszącego 90-112%).
Dietetyczne spożycie białka.
Codzienne spożycie białka oceniano w ciągu trzech dni, stosując dzienniczek żywieniowy zgłoszony przez rodziców. Standaryzowane zapisy dietetyczne i instrukcje zostały dostarczone. Rodzice zostali poinstruowani, aby rejestrować wszystkie spożywane pokarmy i napoje w zapisie diety i wyrażać spożywane ilości tak dokładnie, jak to możliwe. Ilość spożywanego białka (gramy/dzień) obliczono na podstawie skomputeryzowanej wersji holenderskiej bazy danych składu żywności. Holenderska baza danych składu żywności zawiera ponad 2000 produktów żywnościowych wraz z informacjami o ich składzie odżywczym. Baza danych jest szeroko wykorzystywana do celów naukowych (np.).
Urine.
W celu zbadania stężenia AAA w moczu, uczestnicy zbierali cały mocz wydalony w ciągu 18 kolejnych godzin (po godzinach szkolnych) do pojemnika do zbiórki moczu. Podczas zbiórki moczu pojemnik przechowywano w lodówce (<5°C). Próbka o objętości 10 ml była wysyłana do laboratorium w celu analizy, gdzie przechowywano ją w temperaturze -20°C. Do analizy tryptofanu w moczu zastosowano technikę HPLC z detekcją fluorescencyjną. Stężenie tyrozyny i fenyloalaniny w moczu oznaczono przy użyciu analizatora aminokwasów firmy Biochrom . Stężenia tryptofanu, tyrozyny i fenyloalaniny w moczu zostały wyrażone przez stosunek μmoli do całkowitej objętości moczu, aby wykluczyć wpływ wielomoczu lub oligurii. Wiarygodność techniki HPLC została potwierdzona poprzez zbadanie precyzji analiz, która wynosiła 2,25% dla tryptofanu (względne odchylenie standardowe) oraz 1,50% dla tyrozyny i fenyloalaniny. Istnieją wysokie korelacje między stężeniami aminokwasów w próbkach 12-godzinnych i 24-godzinnych, wskazując, że nie ma zmienności dobowej w wydalaniu aminokwasów, walidując użycie 18-godzinnej próbki w obecnym badaniu.
Procedura
Badanie to uzyskało zgodę lokalnej medycznej komisji etycznej Centrum Medycznego Uniwersytetu VU w Amsterdamie, Holandia (#NL39922.029.12), i zostało przeprowadzone zgodnie z normami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku i jej późniejszymi zmianami. Przed udziałem w badaniu uzyskano pisemną świadomą zgodę rodziców wszystkich dzieci oraz dzieci w wieku ≥12 lat. Dzieci z ADHD rekrutowano z poradni zdrowia psychicznego, poprzez stowarzyszenie rodziców dzieci z problemami behawioralnymi oraz poprzez uniwersytecką stronę internetową poświęconą badaniom naukowym. Grupa TD została zrekrutowana ze szkół podstawowych zlokalizowanych na terenie całego kraju. Dzieci przyjmujące leki stymulujące zaprzestały przyjmowania leków na jeden dzień przed udziałem w badaniu (dzień 0), aby zapewnić całkowite wypłukanie, oraz podczas oceny krwi, moczu i przyjmowania pokarmów (od dnia 1 do dnia 3). W dniu 1. plamę krwi pobierano wcześnie rano, aby wykluczyć wpływ dobowej zmienności stężeń AAA we krwi. Tego samego dnia, po zakończeniu zajęć szkolnych, rozpoczęto zbiórkę moczu, która trwała przez następne 18 godzin, aż do powrotu dziecka do szkoły następnego dnia rano (dzień 2). Wczesnym rankiem dnia 1. rodzice otrzymali szczegółowe instrukcje dotyczące sposobu wypełniania karty żywieniowej oraz sposobu zbierania moczu dziecka. Po instruktażu rodzice rozpoczęli zapisywanie diety dziecka, które kontynuowano przez kolejne trzy dni (od dnia 1 do dnia 3). Rodzice i nauczyciele zostali zaproszeni do wypełnienia kwestionariuszy na zabezpieczonej stronie internetowej. Wszystkie dane zostały zebrane w okresie od lutego 2013 do lipca 2014 roku. Grupa ADHD i TD były rekrutowane jednocześnie, aby kontrolować ewentualne efekty sezonowe na spożycie pokarmu lub metabolizm AAA.
Analiza danych
Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programu R, wersja 3.2.1. Wszystkie zmienne zostały skontrolowane pod kątem wartości odstających i brakujących wartości osobno dla grupy ADHD i TD. Winsorising zastosowano do wartości odstających, które zastąpiono wartością o jedną jednostkę większą (lub mniejszą) od poprzedniego najbardziej skrajnego wyniku w rozkładzie grupy. Brakujące dane dotyczące stężeń w moczu, danych żywieniowych i danych behawioralnych były losowo rozdzielane i zastępowane przy użyciu średnich grupowych. W przypadku plamek krwi nie było brakujących danych. Wszystkie dane były normalnie rozłożone, z wyjątkiem objawów CD. Różnice grupowe w płci badano za pomocą testu chi-squared, a różnice grupowe w wieku i funkcjonowaniu behawioralnym badano za pomocą testów t niezależnych próbek.
Aby przetestować pierwszą hipotezę, różnice grupowe w stężeniach AAA w plamkach krwi oceniano za pomocą analizy wariancji (ANOVA) z grupą (ADHD lub TD) jako czynnikiem stałym. Wielkości efektu obliczano w kategoriach częściowej eta kwadrat i interpretowano jako małe (> .01), średnie (> .06) lub duże (> .14). Dodatkowo obliczono ilorazy szans, które wyrażały ryzyko rozpoznania ADHD przy stężeniach AAA poniżej średniej. Dane normatywne dla stężeń AAA uzyskano z dużej próby dzieci w wieku od 6 do 13 lat (N = 104, 52% mężczyzn) (dane niepublikowane, informacje o próbie i wyniki dostępne u autorów). Dla każdego AAA, stężenia odpowiadające najniższemu 16 percentylowi (M-1 SD) próby normatywnej zostały użyte jako wartość progowa do zdefiniowania stężeń AAA poniżej średniej (dla tryptofanu 45 μmole/L, tyrozyny 39 μmole/L i fenyloalaniny 47 μmole/L). Współczynniki szans obliczono wraz z ich 95% przedziałem ufności, a test Fishera wykonano w celu zbadania istotności współczynników szans.
Do testowania drugiej hipotezy, współczynniki korelacji Pearsona iloczynu chwilowego badały związek między stężeniami AAA w plamce krwi a ocenianymi przez rodziców i nauczycieli objawami ADHD. Wielkość współczynników korelacji była interpretowana jako mała (>.10), średnia (>.30) lub duża (>.50). Dane grupy ADHD i grupy TD połączono, aby zmaksymalizować zmienność w pomiarach objawów ADHD.
Aby przetestować trzecią hipotezę, w całej próbie przeprowadzono analizy korelacji między stężeniem AAA w plamce krwi a spożyciem białka i stężeniem AAA w moczu. Zbadano również, czy istniały różnice grupowe w spożyciu białka i stężeniu AAA w moczu, stosując ANOVA z grupą (ADHD lub TD) jako czynnikiem stałym. Wreszcie, w analizach korelacyjnych oceniano, czy stężenie AAA w surowicy krwi było związane z objawami współwystępujących zaburzeń psychicznych zgłaszanymi przez rodziców i nauczycieli (współczynniki korelacji liniowej Pearsona dla ODD i ASD, współczynniki korelacji rang Spearmana dla CD). Jeśli stwierdzono, że objawy ODD, CD lub ASD są związane ze stężeniami AAA, poprzednie analizy przeprowadzono ponownie z tymi objawami wprowadzonymi jako zmienne. Aby skorygować wielokrotne testowanie, poziom alfa analiz korelacji został dostosowany zgodnie z procedurą Bonferroniego dla każdej dziedziny wyników; objawy ADHD (12 analiz, więc p = .004), potencjalne determinanty nieprawidłowości AAA w plamkach krwi (12 analiz, więc p = .004) i objawy współwystępujących zaburzeń psychicznych (18 analiz, więc p = .003). Podano wyniki skorygowane metodą Bonferroniego.