Mechanism of synergistic actin filament pointed end depolymerization by cyclase-associated protein and cofilin

Konstrukcje DNA

Wszystkie mysie białka N-CAP, N-CAP-GFP, wszystkie mysie białka N-CAP, N-CAP-GFP, domena HFD, GST-fuzja domeny HFD i C-końcowa domena ADF-H twinfiliny, zostały sklonowane do bakteryjnego wektora ekspresyjnego pSUMOck4 (uprzejmy dar od Inari Kursula, University of Bergen, Norwegia) w celu wyrażenia białka fuzyjnego znakowanego SUMO, które pozostawia natywne N-końcówki po rozszczepieniu proteazą SENP2. Do konstrukcji domeny CARP i C-CAP użyliśmy bakteryjnego wektora ekspresyjnego pCoofy18 (uprzejmy dar od Addgene). Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konstruktów białkowych i starterów używanych do klonowania konstruktów, patrz Tabela uzupełniająca 2.

Ekspresja i oczyszczanie białek CAP i jej fragmentów

Wszystkie mysie białka CAP i ich fragmenty, z wyjątkiem pełnometrażowego CAP1, ulegały ekspresji w temperaturze +22 °C w pożywce do autoindukcji LB (AIMLB0210, Formedium) przez 24 h w BL21(DE3) E. coli (od Novagen).

Pełnej długości mysi CAP1 był wyrażany w pożywce LB przy użyciu komórek ArcticExpress (DE3) E. coli. Najpierw inokulowaliśmy kulturę startową zawierającą kanamycynę (20 µg/ml) i gentamycynę (20 µg/ml), która była inkubowana przez 6 h w temperaturze +37 °C. Z 3,6-l kultury głównej, zawierającej tylko kanamycynę (20 µg/ml), inokulowano i hodowano do OD600 ~0,4 w temperaturze +37 °C, wytrząsając przy 240 rpm. Temperatura hodowli została zmieniona do +13 °C na 1 h przed ekspresją białek, która została wywołana przez dodanie 0,26 mM IPTG przez 46 h. Wszystkie osady bakteryjne zostały zebrane przez odwirowanie, ponownie zawieszone w 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazolu, pH 7,5, zamrożone w ciekłym N2 i przechowywane w -80 °C.

Wszystkie białka CAP i domena ADF-H twinfiliny zostały oczyszczone przy użyciu podobnej metody. Najpierw bakterie były lizowane przez sonikację w obecności lizozymu (0,5 mg/ml), DNAzy (0,1 mg/ml) i inhibitorów proteaz (200 µg/ml PMSF, 1 µg/ml leupeptyny, 1 µg/ml aprotyniny, 1 µg/ml pepstatyny A; wszystkie z Sigma-Aldrich), a lizat był klarowany przez wirowanie. Supernatant załadowano do 1 ml kolumny HisTrap HP Ni-NTA (GE Healthcare) i obficie przepłukano (>20 objętości kolumny) 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazolu, pH 7,5. Białko było eluowane gradientem 25-250 mM imidazolu na maszynie AKTA Pure (GE Healthcare). Frakcje szczytowe łączono i dodawano proteazę SENP2 do końcowego stężenia 40 µg/ml w celu usunięcia SUMO-tagu. Mieszaninę dializowano O/N w 4 °C przy użyciu rurek dializacyjnych SnakeSkin w 1 l buforu 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7.4. Następnego dnia usunięto rozszczepione SUMO-tagi za pomocą kulek agarozowych Ni-NTA (Qiagen) w przypadkach, gdy rozmiar SUMO-tagów i rozszczepionych białek był jednakowy. Białka zatężano za pomocą filtra wirówkowego Amicon Ultra-4 10 kDa (Merck) i ładowano do kolumny do filtracji żelowej HiLoad 16/600 Superdex 200 (GE Healthcare), kalibrowanej w 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4. Frakcje szczytowe zostały zebrane, skoncentrowane i zamrożone przez snap-freezing w N2 do przechowywania w -80 °C.

Pełnej długości CAP oczyszczono z następującymi wyjątkami. Użyliśmy 5 ml kolumny HisTrap HP Ni-NTA zamiast 1 ml kolumny. Po dializie i filtracji żelowej za pomocą kolumny filtracji żelowej HiLoad 16/60 Superdex 200, główne frakcje szczytowe zostały przepuszczone przez kolumnę filtracji żelowej Superose 6 increase 10/300 GL w celu uzyskania lepszego rozdzielenia mieszaniny stanów oligomerycznych. Wreszcie, główne piki z kilku przebiegów były łączone, zagęszczane w 5-minutowych odstępach wirowania przy użyciu filtra wirówkowego Amicon Ultra-4 30 kDa i przechowywane jak wyżej. Białka CARP i C-CAP oczyszczano jak wyżej, z wyjątkiem użycia proteazy 3C (0,01 mg/ml) do rozszczepienia znaczników.

Inne białka

Aktyna mięśniowa królika, znakowane aktyny, profilina, mysia kofilina-1, białko kapslujące i biotyna-żelsolina zostały przygotowane jak opisano w ref. 16. ADP-aktyna została przygotowana jak opisano w ref. 34. W skrócie, 30 µM roztwór ATP-G-aktyny zawierający 0,3 mM glukozy i 1 jednostkę/ml heksokinazy (Sigma) dializowano wobec buforu do wymiany nukleotydów (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) przez 4 h w 4 °C. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z użyciem króliczej α-aktyny mięśniowej.

Actin pointed end depolymerization assays

Pomiar szybkości depolimeryzacji spiczastych końców filamentu aktynowego przeprowadzono przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego sparowanego z zestawem mikroskopowym, jak opisano16. W skrócie, przygotowaliśmy komorę z polidimetylosiloksanem (PDMS, Sylgard), która została zamontowana na oczyszczonym szkiełku nakrywkowym. Komory mikroprzepływowe miały wysokość 20 µm. Trzy wloty i wylot podłączone były do sterowanych ciśnieniem rurek wypełnionych roztworami o różnym składzie biochemicznym (Fluigent microfluidics device).

Po zamontowaniu komory płukano dH20 i buforem F (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT i 1 mM DABCO). Następnie komorę kolejno poddawano działaniu: 150 µl 0,1% biotyny-BSA w buforze F; 300 µl 5% BSA; 150 µl 3 µg/ml neutravidin w buforze F oraz 10-100 µl 1-3 pM biotyny-gelsoliny. Przed eksperymentami filamenty aktynowe polimeryzowano (8 µM, >30 min) w buforze F. Frakcja monomerów aktyny była znakowana Alexa-488 lub 568. Filamenty ostatecznie wstrzykiwano do komory i zakotwiczano do szkiełka nakrywkowego przez gelsoliny aż do uzyskania pożądanej gęstości.

Aby zmierzyć szybkość depolimeryzacji ozdobionych kofiliną spiczastych końców, filamenty najpierw nasycano 2 µM kofiliny, a następnie wystawiano na działanie 2 µM kofiliny uzupełnionej różnymi białkami CAP. Szybkość depolimeryzacji analizowano za pomocą programu ImageJ, wykonując najpierw kymograf dla każdego filamentu (funkcja reslice) i ręcznie dopasowując nachylenie wzdłuż spiczastego końca. Filamenty, których spiczaste końce nie mogły być wyraźnie prześledzone lub miały możliwe (nie)obserwowane pauzy53 lub zdarzenia odcinania zostały odrzucone z analizy.

Aby zminimalizować wpływ znakowania białek na nasze pomiary, użyliśmy 10% lub 16% frakcji znakowania aktyny w zależności od konfiguracji mikroskopu. Nie zaobserwowaliśmy wpływu frakcji znakowania na aktywność N-CAP w naszych eksperymentach. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w temperaturze pokojowej, w układzie niekontrolowanym termicznie.

Reannealing of actin filaments

Preformowane, stabilne roztwory F-aktyny (w buforze F) z różnymi etykietami fluorescencyjnymi zostały zmieszane i inkubowane w celu ilościowego określenia reannealingu. Zmieszany roztwór zawierał 4 µM Alexa568-aktyny (znakowanej w 10%) i 4 µM Alexa488-aktyny (znakowanej w 10%), z lub bez N-CAP i mutantów. Po 4 min w temperaturze pokojowej, zmieszany roztwór F-aktyny rozcieńczano 100x w buforze uzupełnionym 0,2% metylocelulozą i przepuszczano do otwartej komory wykonanej z taśmy dwustronnej umieszczonej pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi i pasywowanej BSA. Serie obrazów (odstęp 2 s) były rejestrowane w co najmniej trzech różnych polach widzenia. Zliczano liczbę zielonych (Alexa488) segmentów F-aktyny, jak również liczbę tych segmentów, które były połączone z czerwonym (Alexa568) segmentem F-aktyny, w celu określenia stosunku dwóch kolorowych segmentów przedstawionych na Rys. 2f. Monitorowanie dyfuzji filamentów pozwoliło nam jednoznacznie określić, kiedy dwa segmenty zostały połączone. Kontrole (bez N-CAP w mieszaninie z F-aktyną) były powtarzane kilkakrotnie, a eksperymenty (z N-CAP lub mutantami) co najmniej dwukrotnie.

Actin severing assays

Aby zbadać wpływ N-CAP na zrywanie przez kofilinę, zastosowaliśmy dwie różne metody, albo (1) mierząc frakcję pojedynczych domen kofiliny, które jeszcze nie doprowadziły do zerwania, albo (2) kwantyfikując globalną liczbę zdarzeń zerwania na µm filamentu aktynowego.

(1) Zerwanie związane z pojedynczymi domenami kofiliny (Supplementary Fig. 3c). Postępowaliśmy zgodnie z procedurą opisaną wcześniej16. Krótko mówiąc, wewnątrz komory mikroprzepływowej, 12% znakowane Alexa-488 filamenty aktynowe polimeryzowano z nasion spektryny-aktyny, zakotwiczonych niespecyficznie do szkiełka nakrywkowego aktywowanego BSA. Filamenty starzono przez 15 min z roztworem G-aktyny w stężeniu krytycznym (100 nM G-aktyny), tak aby filamenty stały się >99% ADP46. Następnie filamenty poddawano ciągłej ekspozycji na 500 nM mCherry-cofilin-1 samodzielnie, z 2 µM pełnometrażowego CAP1 lub z 10 µM N-CAP. W ImageJ, kymografy filamentów zostały skonstruowane w celu śledzenia nukleacji i montażu pojedynczych domen kofiliny i zdarzeń zrywania na interfejsie z gołymi segmentami aktyny.

Dla każdej domeny, czas 0 został zdefiniowany w ramce, na której się nukleowały. Następnie zarejestrowaliśmy albo czas, w którym wywołały zdarzenie zerwania, albo kiedy zostały utracone z powodu zerwania przez inną domenę, łączenia się lub zdarzenia cenzurowania. Frakcja domen, które nie wywołały zdarzenia odcinania, została następnie obliczona przy użyciu klasycznej metody Kaplana-Meiera.

(2) Całkowita liczba zdarzeń odcinania/µm (Supplementary Fig. 3d). Wewnątrz komór przepływowych (pomiędzy dwiema szkiełkami nakrywkowymi oddzielonymi taśmą dwustronną) wstrzykiwano najpierw prepolimeryzowane filamenty znakowane Alexa-488 (w buforze F, z 0,2-0,3% metylocelulozy). Następnie roztwór wymieniano z 500 nM nieznakowanej kofiliny-1 i 0, 1 lub 10 µM NCAP. Po wymianie filamenty, które pozostały przy powierzchni analizowano w następujący sposób.

Liczbę zdarzeń zerwania na µm obliczono jako funkcję kumulatywną

gdzie Nsev(u) jest liczbą zdarzeń zerwania w czasie u, a \(\mathop {sum}nolimits_i {l_{i(u)}} jest sumą długości wszystkich włókien i w czasie u. Ponieważ roztwór nie zawiera G-aktyny, filamenty ulegają depolimeryzacji, a długość filamentu maleje z czasem.

Wiązanie N-CAP z filamentami o spiczastych końcach

Doświadczenie przeprowadzono w komorach przepływowych (patrz: Actin severing assay (2)), pasywowanych biotyną-PLL-PEG i sfunkcjonalizowanych neutravidiną. F-aktyna (10% Alexa-568, 1% biotyna) była polimeryzowana przez noc w stężeniu 4 µM. Tuż przed wstrzyknięciem do komory, F-aktynę rozcieńczano do 200 nM i mieszano z 100 nM N-CAP-GFP, 2 µM kofiliny-1 i 4 nM białka kapslującego, w buforze F uzupełnionym 0,2% metylocelulozą. Obrazy filamentów aktynowych były pozyskiwane przed i po strumieniowej akwizycji kanału GFP (5 klatek/sekundę przez 12 s, mikroskopia TIRF). Do analizy wiązania z końcami filamentów ślepo wybierano filamenty aktynowe, które nie poruszały się podczas akwizycji strumienia. Fluorescencja była mierzona na dwóch końcach każdego filamentu, na obszarze 3 na 3 piksele. Zdarzenie wiązania było wykrywane, gdy fluorescencja przekraczała arbitralnie ustalony próg (ta sama wartość dla wszystkich filamentów i końców filamentów). Ponieważ białko kapsydowe powinno chronić kolczasty koniec, spiczasty koniec został przypisany do tego z największą liczbą zdarzeń wiążących. N-CAP-GFP wykryto w 17% punktów danych na spiczastym końcu filamentu, podczas gdy niespecyficzne wiązanie N-CAP-GFP w pobliżu kolczastego końca filamentu wykryto w 1,7% punktów danych. Frakcja przeżycia N-CAP na spiczastym końcu została następnie obliczona i dopasowana do pojedynczego wykładnika, aby zmierzyć szybkość niewiązania.

Krystalizacja i określenie struktury

Myszowa domena HFD została skrystalizowana z obecnością 10×His-tag i oczyszczona jak opisano powyżej, z wyjątkiem użycia 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5 buforu w filtracji żelowej. Próbkę przed krystalizacją zagęszczono do 7-10 mg/ml i zmieszano w proporcji 1:1 z 0,1 M kakodylanem sodu, 12% PEG4000 (w/v), pH 6.1 metodą kropli siedzącej o wielkości kropli 200 nl w 96-dołkowym formacie. Po 2 tygodniach inkubacji zaobserwowano duże, igiełkowate kryształy. W celu zdalnego zbierania danych w Diamond Light Source (UK, Didgot) na linii I03 kryształy zostały zabezpieczone przez namoczenie w płynie macierzystym zawierającym 25% glicerolu i zamrożone w N2 w celu dostarczenia do linii. Dane zostały zebrane w temperaturze 100 K przy długości fali 0.9763 Å, detektorze Pilatus3 6M, 30% mocy nadawania, ekspozycji 0.05 s i kącie oscylacji 0.1°, w sumie 2400 klatek. Dane dyfrakcyjne zostały zintegrowane i przeskalowane za pomocą oprogramowania X-ray Detector Software (XDS)54. Wstępne rozwiązanie otrzymano za pomocą zastępowania molekularnego przy użyciu programu PHASER55 i PDB = 1s0p jako modelu wyszukiwania. Znaleziono rozwiązanie z czterema domenami HFD obecnymi w asymetrycznej jednostce, po którym wielokrotne rundy rafinacji za pomocą BUSTER56 i ręcznego budowania w COOT57 dały dobre dopasowanie do danych (patrz Tabela 1). Dalszą poprawę uzyskano rafinując dane przez wprowadzenie parametrów translacja-liberacja-śruby (1/łańcuch), usunięcie ograniczeń niekrystalograficznych i modelowanie indywidualnych atomowych współczynników B. Ostateczna Rwork/Rfree dla modelu wynosiła 18,6%/23,0% z dobrą ogólną geometrią.

Do krystalizacji trójdzielnego kompleksu (z ADP-aktyny, domeny HFD myszy CAP1 i C-końcowej domeny ADF-H myszy twinfilin-1), ADP-aktynę przygotowano w dializie O/N w temperaturze +4 °C w 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0.2 mM ADP, 0.2 mM EGTA, 0.3 mM glukozy, 0.5 mM β-merkaptoetanolu, pH 8.0. Roztwór aktyny, zawierający 0,3 mM glukozy i 5 U/ml heksokinazy, przenoszono na membranę dializacyjną Slide-A-Lyser i umieszczano na urządzeniu flokującym w temperaturze +4 °C. Następnego dnia przed utworzeniem kompleksu aktynę odwirowywano przez 20 min przy 355 040 × g z użyciem rotora TLA-120. Białka mieszano w stosunku 1:1,1:1,1 (aktyna, domena HFD, domena ADF-H), zatężano do 10-20 mg/ml i używano do krystalizacji jak wyżej. Trafienia uzyskano w kilku różnych warunkach, a najlepiej dyfraktujący kryształ uzyskano przy stężeniu ~10 mg/ml kompleksu zmieszanego 1:1 w 0.1 M HEPES, 0.1 mM KCl, 10% PEG4000 (w/v), pH 7.0 przy wielkości kropli 200 nl. Pierwszego dnia w kropli pojawiło się kilka małych kryształów w kształcie rombów. Trzeciego dnia pojawił się duży kryształ przypominający pręt, podczas gdy wszystkie małe kryształy zostały rozpuszczone. Do zdalnego zbierania danych w Diamond Light Source (UK, Didgot) na beamline I03, kryształy zostały zabezpieczone krio-ochronnie przez nasączenie LV CryoOil (MiTeGen) i zamrożone w N2 do transportu. Dane zostały zebrane w temperaturze 100 K przy długości fali 0.9762 Å, detektorze Pilatus3 6M, 20% mocy nadawczej, ekspozycji 0.05 s i kącie oscylacji 0.15° jako całkowita liczba 2400 klatek. Dane dyfrakcyjne zostały zintegrowane i przeskalowane za pomocą programu XDS54. Wstępne rozwiązanie uzyskano za pomocą wymiany molekularnej przy użyciu programu PHASER55 i PDB = 3daw jako modelu wyszukiwania, który wykazał wyraźną dodatkową gęstość w spiczastym końcu monomeru aktyny. Przeprowadzono więc kolejną wymianę molekularną i otrzymano wstępny model kompleksu trójdzielnego za pomocą programu BALBES58 z 3daw i 1s0p jako modelami poszukiwań. Otrzymano rozwiązanie o Q = 0,787 i Rwork/Rfree = 29,7%/35,6%. Jednostka asymetryczna zawierała pojedynczy kompleks 1:1:1 HFD:ADF-H:ADP-aktyna. W celu poprawy modelu konieczne były wielokrotne rundy rafinacji za pomocą BUSTERa56 oraz ręczne budowanie w COOT57 , w szczególności przebudowa pętli D i pętli łączących α-heliksy w domenie HFD. Ostatecznie, dodanie wód, wprowadzenie parametrów translacyjnych-libration-screw (1/chain) i indywidualne modelowanie atomowego czynnika B dało model z końcowym Rwork/Rfree 16.6%/19.4% z dobrą ogólną geometrią.

Badanie oddziaływań białko-białko metodą filtracji żelowej

Do badania wiązania monomeru aktyny, ADP-G-aktyna została przygotowana jak opisano w ref. 34. Wszystkie eksperymenty filtracji żelowej przeprowadzono w temperaturze +4 °C z prędkością 0,5 ml/min i frakcjonowaniem 0,5 ml przy użyciu kolumny do filtracji żelowej Superdex 200 increase 10/300 GL wyrównanej w 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4. Sto mikrolitrów kompleksu zawierającego 18 µM domeny ADF-H twinfiliny, 15 µM innych białek nastrzykiwano na kolumnę i analizowano pod kątem elucji. Frakcje szczytowe analizowano również metodą SDS-PAGE. Eksperymenty z konkurencją monomerów aktyny przeprowadzono jak wyżej, dodając do próbek 15 µM domeny C-CAP lub CARP. Frakcje szczytowe analizowano na SDS-PAGE, żele obrazowano za pomocą systemu obrazowania ChemiDoc XRS + (Bio-Rad) i kwantyfikowano za pomocą Image Lab (Bio-Rad).

Native-PAGE

Żele Mini-Protean TGX 10% (Bio-Rad) były wstępnie prowadzone w schłodzonym buforze bieżącym (25 mM Tris, 195 mM glicyna, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) przez 1 h przed załadowaniem. Próbki przygotowywano w buforze dializacyjnym ADP-aktyna (5 mM HEPES lub Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glukozy, 0,1 mM DTT, pH 8.0) w stężeniu 20 µM każdego białka, mieszano w stosunku 1:1 z 2× buforem obciążającym (bufor zawierający 20% glicerolu, błękit bromofenolowy, bez ADP i MgCl2), a następnie nakładano po 5 µl objętości do studzienek z próbkami o objętości 50 µl. Żele prowadzono pod napięciem 100 V na lodzie przez 4 h.

Fluorometryczny test demontażu filamentów aktyny

Demontaż filamentów ADP-aktyny w stanie ustalonym przeprowadzono w następujący sposób: 5% piren-aktyna była polimeryzowana w 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4 przez 60 min. Końce kolczaste filamentu były kapturowane przez 50 nM białka kapturującego. Następnie dodawano 0,5 µM kofiliny (i 0,5 µM N-CAP), a reakcję rozpoczynano od dodania 4 µM białka wiążącego witaminę D (czynnik sekwestrujący monomery). Końcowe stężenie aktyny wynosiło 2,5 µM. Rozpad aktyny mierzono śledząc fluorescencję pirenu ze wzbudzeniem przy 365 nm i emisją przy 407 nm na spektrofotometrze fluorescencyjnym (Agilent) przez 2400 s w 22 °C.

Spektrometria CD

Widma CD dla typu dzikiego N-CAP, mutantów i domeny HFD mierzono w temperaturze 20 °C za pomocą spektropolarymetru J-720 (Jasco), w 300 µl kuwecie kwarcowej o długości drogi światła 0,1 cm z następującymi parametrami: tryb ciągłego skanowania z prędkością skanowania 50 nm/min, szerokość pasma 0,5 nm, zakres fal 190-260 nm, skok danych 0,5 nm. Wszystkie białka rozcieńczano do 15 µM w 10% buforze PBS. Akumulacja dziesięciu skanów dla każdego białka została wykreślona jako pojedyncza krzywa.

Modele do atomistycznych symulacji MD

Modele aktynowe ozdobione kofiliną zostały oparte na strukturze z mikroskopii krioelektronowej o rozdzielczości 3,8 Å (PDBID: 5YU8)41. Brakujące pętle zostały zbudowane przy użyciu RosettaCM59 i RosettaScripts60 w obecności mapy gęstości elektronowej41 narzucającej związaną z nią symetrię helikalną. Aby dopasować konstrukty eksperymentalne w tej pracy, sekwencje aktyny i kofiliny zostały na tym etapie zmienione z kurzych na odpowiednio królicze i mysie. Wygenerowano ponad 1000 modeli. Następnie posortowano je na podstawie sumy punktów i odfiltrowano te, które zawierały artefakty strukturalne (np. wiązania peptydowe cis). Symulacje dynamiki molekularnej (MD) rozpoczęto od trzech najwyżej punktowanych modeli (Tabela uzupełniająca 1, symulacje F1-3).

Kompleks HFD-aktyna został wyizolowany ze skrystalizowanego kompleksu domena HFD/aktyna/dwufilina domeny ADF-H i oddzielnie zadokowany do wybranych modeli filamentu aktynu ozdobionego kofiliną, opisanych powyżej. W tym celu wyizolowana HFD-aktyna została nałożona na każdy monomer aktyny o spiczastym końcu, który następnie zastąpiono HFD-aktyną. W ten sposób konformacja struktury krystalicznej dimeru aktyn-HFD została przeniesiona na końcówkę aktynu dekorowanego kofiliną. Zadokowane modele były najpierw lokalnie rafinowane przy użyciu protokołu dokowania61 , a następnie poddawane relaksacji za pomocą protokołu fast relax62 , rozprowadzanego w pakiecie Rosetta Software Suite. Proces ten zastosowano oddzielnie dla każdego filamentu aktynu dekorowanego kofiliną wybranego do symulacji MD (Tabela uzupełniająca 1, symulacje C1-3).

Konstrukcja spiczastego segmentu końcowego do symulacji MD

Każdą symulację przeprowadzono na spiczastym segmencie końcowym wybranego modelu filamentu aktynu dekorowanego kofiliną, który utworzono przez pocięcie modelu prostopadle do osi filamentu. Płaszczyzna cięcia została tak dobrana, aby w segmencie znalazły się cztery całe monomery aktyny związane ADP-Mg2+ i trzy całe monomery kofiliny (Tabela uzupełniająca 1, symulacje F1-3). Segment zawierał również dwie domeny HFD na spiczastym końcu w układach związanych z HFD (Tabela uzupełniająca 1, symulacje C1-3). Segment ze spiczastym końcem zawierał również kilka fragmentów polipeptydowych pochodzących od kofilin i aktyn na jego kolczastym końcu (Supplementary Fig. 5a). Aby utrzymać ich konformację i położenie podczas symulacji, te przerwane łańcuchy były ograniczone pozycyjnie przez cały czas trwania symulacji w następujący sposób: warstwa reszt na interfejsie z resztą spiczastego segmentu końcowego została pozostawiona wolna; wszystkie ciężkie atomy w pobliżu płaszczyzny krojenia i tylko ciężkie atomy szkieletu dla regionów pomiędzy nimi zostały skrępowane stałą siły 100 kJ/mol/nm2 (Supplementary Fig. 5a). Te częściowo skrępowane fragmenty polipeptydowe na kolczastym końcu działają jako platforma podczas symulacji. Takie podejście utrzymuje zarówno filamentowy interfejs białko-białko na kolczastym końcu, jak i orientację filamentu podczas symulacji.

Stany protonacyjne reszt zostały określone w neutralnym pH na podstawie obliczeń pKa przy użyciu programu PROPKA363. Każda reszta H73 aktyny została zmetylowana (Nτ-Methyl-l-histidine, HIC), a N-końcówki aktyny, kofiliny i HFD zostały acetylowane. Topologie dla każdej cząsteczki w układach zostały przygotowane za pomocą programu LeAP rozprowadzanego z ambertools1864, które następnie zostały przekonwertowane do formatu GROMACS za pomocą narzędzia ParmEd.

Każdy spiczasty plasterek końcowy utworzony z wybranych modeli został umieszczony w pudełku symulacyjnym graniastosłupa sześciokątnego, którego oś długa była wyrównana z osią z. Wymiary pudełka zostały tak dobrane, aby minimalna odległość pomiędzy filamentem a każdą ścianą pudełka wynosiła około 17 Å (Tabela 1). Każdy układ solwatowano 0.15 M roztworem NaCl z liczbą jonów dostosowaną do neutralizacji układu.

Przed uruchomieniem produkcji przeprowadzono minimalizację typu steepest descent i kolejne krótkie symulacje equilibracyjne (w sumie ~7 ns) w zespołach NVT i NpT z użyciem termostatu Berendsena i barostatu65. Podczas tych symulacji wyrównawczych, do spiczastego wycinka końcowego zastosowano harmoniczne ograniczenia położenia. Mniejsza grupa atomów (wszystkie ciężkie atomy, szkielet białka, i w końcu tylko atomy Cα) były ograniczane w każdej kolejnej symulacji równoważenia ze stałą siłą 1000 kJ/mol/nm2.

Układy, które były rozgałęzione od pozostałych (Tabela Dodatkowa 1; C1′, C2′. F2′) zostały przygotowane przez dokonanie odpowiedniej modyfikacji (dokowanie lub usunięcie domen HFD), usunięcie nakładających się cząsteczek rozpuszczalnika (gdy domeny HFD były zadokowane) i ponowne dostosowanie rozmiaru pudełka i atomów rozpuszczalnika dla nowego rozmiaru układu. Etapowe równoważenie NVT i NpT z ograniczeniami przeprowadzono jak wspomniano powyżej (w sumie ~200 ps dla symulacji, w których domeny HFD zostały usunięte, i w sumie ~4 ns, gdy są zadokowane).

Wszystkie przebiegi produkcyjne były wykonywane przez 1-2.5 μs w zespole NpT z tylko wspomnianymi wcześniej ograniczeniami pozycyjnymi na regionie platformy.

Pola siłowe i parametry w symulacjach MD

W symulacjach MD zastosowano następujące pola siłowe i zestawy parametrów: Amber ff14sb66 dla białek, model TIP3P67 dla wody, zestaw parametrów dla jonów monowalentnych autorstwa Jounga i Cheathama68 dla Na+ i Cl-, oktaedryczny model jonów multisite autorstwa Saxeny i Sept69 dla Mg2+ oraz zestaw parametrów dla związków polifosforylowanych autorstwa Meaghera i wsp.70 dla ADP. Brakujące parametry wiązania dla metylo-histydyny (Nτ-Methyl-l-histidine, HIC) zostały zaadoptowane z pola siłowego GAFF264. Ładunki atomowe obliczono zgodnie z protokołem Duan i wsp.71 Do dopasowania wieloskładnikowego potencjału elektrostatycznego (RESP) wykorzystano oprogramowanie R.E.D.III.5, stosując rozszerzoną i α-helikalną konformację dipeptydu HIC (Ace-HIC-Nme). Wszystkie obliczenia kwantowo-chemiczne zostały wykonane przy użyciu pakietu programu Gaussian0973 na poziomie teorii b3LYP/cc-pVTZ. Obliczenia ładunkowe wykonano przy użyciu modelu IEFPCM w polaryzowalnym kontinuum o stałej dielektrycznej 4 ustawiając rozpuszczalnik jako eter.

Protokoły symulacji MD

Wszystkie symulacje przeprowadzono przy użyciu programu GROMACS 2018 74. Równania ruchu zostały zintegrowane przy użyciu algorytmu leap-frog z krokiem czasowym 2 fs. Wszystkie wiązania były ograniczone przy użyciu algorytmu LINCS75. Protokoły symulacyjne zostały dobrane zgodnie z ref. 66. Oddziaływania elektrostatyczne dalekiego zasięgu potraktowano gładką siatką cząsteczkową Ewalda76 z odcięciem w przestrzeni rzeczywistej 0.8 nm, odstępem Fouriera 0.12 nm i interpolacją czwartego rzędu. Dla oddziaływań van der Waalsa zastosowano potencjał Lennarda-Jonesa z odcięciem 0.8 nm. Długozasięgowe poprawki dyspersyjne zostały zastosowane dla energii i ciśnienia77.

Wszystkie symulacje produkcyjne zostały przeprowadzone w zespole NpT. Spiczasty plasterek końcowy, platforma i rozpuszczalnik (woda i 0.15 M NaCl) były sprzężone z oddzielnymi łaźniami temperaturowymi w temperaturze 310 °K przy użyciu termostatu Nosé-Hoovera78,79 ze stałą czasową 1.0 ps. Izotropowe sprzężenie ciśnieniowe wykonano przy użyciu barostatu Parrinello-Rahmana80 z ciśnieniem odniesienia 1 atm, stałą czasową 5 ps i ściśliwością 4.5 × 10-5 bar-1.

Analiza symulacji MD

Wszystkie analizy wykonano przy użyciu VMD81 i własnych skryptów. Obliczenia MMGBSA wykonano przy użyciu programu MMPBSA.py82 rozprowadzanego wraz z ambertools1864 , stosując zmodyfikowany model GB opracowany przez Onufrieva i in.83 przy stężeniu soli 0,15 M (ramki próbkowane co 100 ns odrzucając pierwsze 500 ns każdej symulacji).

Analizy strukturalne

Do analizy różnych struktur aktyny i ich stanów konformacyjnych przedstawionych na Rys. 1d, zastosowaliśmy protokół autorstwa Tanaka i wsp.41,84. używając struktury F-aktyny (PDB 6djo) jako odniesienia.

Analiza statystyczna i odtwarzalność

Dane na Fig. 2d, 4b i 4d zostały połączone z kilku eksperymentów wykonanych w różnych dniach, reprezentując w ten sposób dane z kilku niezależnych eksperymentów. Panele 2f, 2g, 2h i 3d przedstawiają dane analizowane z pojedynczego reprezentatywnego eksperymentu. n opisuje liczbę filamentów analizowanych dla paneli 2d, 2f, 2g, 4b i 4d. n w panelu 6c odpowiada liczbie powtórzeń, w których przeprowadzono eksperyment.

Doświadczenia na rysunkach uzupełniających 2a-d, 3c, 6a-d zostały wykonane z podobnymi wynikami co najmniej dwukrotnie. Eksperymenty w 3d, eksperyment konkurencji domeny CARP w 6a, i eksperymenty w warunkach promujących montaż w Fig. 7 zostały przeprowadzone raz.

Podsumowanie sprawozdawczości

Dalsze informacje na temat projektowania badań są dostępne w Nature Research Reporting Summary powiązanym z tym artykułem.

.