In vivo RyR1 reduction in muscle triggers a core-like myopathy

Generation of the RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 model myszy

Linia myszy z miejscami loxP wstawionymi po obu stronach eksonów 9-11 genu RYR1 (tzw. RyR1Flox/Flox) została skojarzona z linią myszy HSA-Cre-ERT2 wyrażającą zależną od tamoksyfenu rekombinazę Cre-ERT2 pod kontrolą ludzkiego genu α-aktyny mięśni szkieletowych, aby utworzyć RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2. Wstrzyknięcie tamoksyfenu indukuje aktywację rekombinazy Cre-ERT2 selektywnie w mięśniach szkieletowych, co skutkuje delecją eksonów 9-11 i przerwaniem ciągłości genu RYR1 w mięśniach szkieletowych ze ścisłą zależnością od tamoksyfenu (ryc. 1a). W chwili urodzenia myszy RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 były normalne, a w wieku 2 miesięcy, gdy były już młodymi dorosłymi, rekombinację indukowano wstrzyknięciem tamoksyfenu (od tego momentu zrekombinowane zwierzęta nazywano RyR1-Rec). Molekularne i fizjologiczne konsekwencje były dalej badane w funkcji czasu, aż do 105 dni po indukcji rekombinacji (Rys. 1b). Zwierzęta kontrolne (CTRL) to osobniki RyR1Flox/Flox (bez transgenu HSA-Cre-ERT2), którym wstrzyknięto tamoksyfen. Ogólny fenotyp zrekombinowanych myszy w wieku 75 dni charakteryzuje się kifozą związaną z nieprawidłową ruchomością tylnych kończyn i wadliwym chodem. Zwierzęta nadal są w stanie stać na tylnych łapach w celu pobierania pokarmu, ale w miarę postępu choroby granulki z pokarmem były systematycznie podawane bezpośrednio do klatki. W wieku 105 dni zwierzęta są nadal zdolne do poruszania się w klatkach i nie zaobserwowano zwiększonej śmiertelności w porównaniu do CTRL. Choroba dotyczyła zarówno samców jak i samic. Względna ilość RyR1 na poziomie mRNA była analizowana w mięśniu czworogłowym co 15 dni po rekombinacji przy użyciu RT-q-PCR u zwierząt CTRL i RyR1-Rec (ryc. 1c). Zaobserwowano szybki spadek RyR1 mRNA, przy czym niski i stabilny poziom 21% ± 4% wartości początkowej został osiągnięty już po 3 dniach od iniekcji tamoksyfenu. Redukcję zaobserwowano we wszystkich badanych mięśniach 75 dni po indukcji rekombinacji (Quadriceps, tibialis anterior, EDL, soleus, plik dodatkowy 1: ryc. S1A). Ilość białka RyR1 była dalej analizowana przy użyciu ilościowego Western blot w homogenatach mięśniowych mięśnia czworogłowego (ryc. 1d, e). Ilość ta ulegała stopniowej redukcji i osiągnęła około 50% wartości początkowej po 105 dniach. W dłuższych okresach nie obserwowano dalszej redukcji białka RyR1 (dane nie przedstawione). Ilość białka RyR1 oznaczono ilościowo w różnych homogenatach mięśniowych 75 dni po rekombinacji. Redukcję zaobserwowano we wszystkich badanych mięśniach, chociaż pozostała ilość nieznacznie różniła się pomiędzy mięśniami, największa była w mięśniu międzykostnym (64% ± 5%), a najmniejsza w mięśniu podeszwowym (33% ± 5%) (plik dodatkowy 1: ryc. S1B).

Myszy RyR1-Rec wykazują postępującą redukcję masy mięśniowej i masy ciała oraz siły mięśniowej

Konsekwencje redukcji RyR1 badano najpierw na poziomie całego zwierzęcia. Początkowo przy tej samej wadze, zwierzęta CTRL powoli przybierały na wadze od 24,4 ± 0,4 do 30,6 ± 0,8 g w D90, podczas gdy zwierzęta RyR1-Rec stopniowo traciły na wadze do 20,6 ± 1,3 g w D90 (ryc. 2a). Zarówno samce, jak i samice były dotknięte tym problemem i straciły około 13% początkowej masy ciała po 75 dniach (plik dodatkowy 1: ryc. S1C). Jest to wynik utraty masy ciała obserwowany we wszystkich mięśniach (plik dodatkowy 1: ryc. S1D). Aby zbadać ogólną sprawność mięśni po redukcji RyR1, zwierzęta poddano dwóm różnym testom siły. Najpierw pozwolono im zwisać chwytając powierzchnię z drutu poprzecznego wszystkimi czterema łapami do 5 min, przy czym latencja do upadku odzwierciedlała siłę mięśniową. Test chwytny wykonywany co tydzień przez 105 dni (ryc. 2b) wykazał, że zwierzęta RyR1-Rec zaczęły tracić siłę 20-30 dni po iniekcji tamoksyfenu, kiedy ilość RyR1 wynosiła około 75-80% wartości początkowej, a około 75 dni po iniekcji tamoksyfenu nie były w stanie zwisać na siatce, ponieważ ilość RyR1 osiągnęła poziom około 60%. Siłę mięśniową oceniano również za pomocą 6-minutowego protokołu nieinwazyjnej elektrostymulacji mięśnia brzuchatego łydki w połączeniu z anatomicznym rezonansem magnetycznym (MRI) w znieczuleniu ogólnym. Podczas protokołu elektrostymulacji zwierząt CTRL 30 dni po iniekcji tamoksyfenu (ryc. 2c, D30) zarejestrowano typowy profil wysiłkowy, ze stabilną początkową siłą mięśniową, która powoli zmniejszała się w miarę zmęczenia mięśnia. W grupie CTRL w D60 i D90 profil wysiłkowy wykazywał poprawę siły mięśniowej w miarę starzenia się zwierząt (ryc. 2c). Z kolei sprawność zwierząt RyR1-Rec, podobnie jak CTRL w D30, pogarszała się wraz z wiekiem. Zwierzęta RyR1-Rec nie były już w stanie wykonać ćwiczenia w D90 (Ryc. 2c, RyR1-Rec D90). Objętość mięśnia brzuchatego mierzona za pomocą obrazów MR (ryc. 2d) pozostawała stabilna u zwierząt CTRL od D30 (161 ± 5 mm3) do D90 (164 ± 4 mm3). Z kolei u myszy RyR1-Rec objętość mięśnia brzuchatego była istotnie mniejsza niż u myszy CTRL od D30 (141 ± 3 mm3, p = 0,003), a następnie uległa dalszej redukcji do 100 ± 3 mm3 w D60 (p < 0,001 w porównaniu z CTRL w tym samym wieku) i 69 ± 4 mm3 w D90 (p < 0,001 w porównaniu z CTRL w tym samym wieku). Maksymalne specyficzne napięcie skurczowe (bezwzględne napięcie skurczowe znormalizowane do objętości mięśnia) potwierdza, że obie grupy prezentowały podobną siłę mięśniową w D30 (ryc. 2e), ale siła RyR1-Rec drastycznie spadała, podczas gdy u zwierząt CTRL wzrastała wraz z wiekiem. Dodatkowo, zmiany w bioenergetyce mięśnia brzuchatego łydki podczas elektrostymulacji oceniano nieinwazyjnie w D60, stosując in vivo spektroskopię MR z 31-fosforem (31P). Podczas gdy podstawowe pH wewnątrzmięśniowe nie różniło się między obiema grupami (plik dodatkowy 1: ryc. S2A), stopień kwasicy pod koniec ćwiczenia był niższy (p = 0,016) u zwierząt RyR1 Rec (plik dodatkowy 1: ryc. S2B), co sugeruje, że strumień glikolityczny w ćwiczącym mięśniu był zmniejszony u tych zwierząt. Co więcej, stała czasowa powysiłkowej resyntezy fosfokreatyny (τPCr) była znacząco krótsza (p = 0,047) u myszy RyR1-Rec (plik dodatkowy 1: Fig. S2C, D), odzwierciedlając lepszą funkcję mitochondriów in vivo. Rzeczywiście, synteza PCr podczas okresu regeneracji po wysiłku opiera się wyłącznie na oksydacyjnej syntezie ATP, dlatego τPCr jest uważany za wskaźnik zdolności fosforylacji oksydacyjnej . Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują, że postępująca redukcja RyR1 wiąże się z postępującą utratą masy ciała i spadkiem siły mięśniowej.

Fizjologiczne właściwości izolowanych włókien są upośledzone u myszy RyR1-Rec

Zmiana funkcji mięśni była dalej charakteryzowana na poziomie pojedynczego włókna mięśniowego przy użyciu kombinacji całokomórkowego voltage-clamp i obrazowania konfokalnego. Sieć T-tubul była obrazowana przez barwienie błony plazmatycznej di-8-aneppsem. Nie zaobserwowano jakościowej różnicy w sieci (ryc. 3a, po lewej) ani ilościowej różnicy w średniej gęstości T-tubul między włóknami CTRL i RyR1-Rec, oprócz niewielkiego, ale znaczącego skrócenia średniej długości spoczynkowej sarkomerów (ryc. 3a, wykresy po prawej). Równocześnie oceniano aktywowany napięciem napływ Ca2+ przez DHPR (ryc. 3b-d) oraz strumień uwalniania Ca2+ przez RyR1 (ryc. 3e-i). W porównaniu z włóknami CTRL, włókna RyR1-Rec wykazywały aktywowane napięciem prądy DHPR Ca2+ o podobnym przebiegu czasowym (ryc. 3b), ale o zmniejszonej gęstości, na co wskazuje zależność szczytowej gęstości prądu od napięcia w obu grupach (ryc. 3c), co przekładało się na 30% zmniejszenie maksymalnej konduktancji (Gmax), bez towarzyszących zmian innych parametrów zależności prądu od napięcia (ryc. 3d). Zależność napięciową uwalniania SR Ca2+ oceniano na podstawie obrazowania line-scan barwnika wrażliwego na Ca2+ – rhod-2. Obrazy line-scan z włókien RyR1-Rec były jakościowo podobne do tych z włókien CTRL (ryc. 3e), wykazując szybki wzrost fluorescencji po depolaryzacji błony T-tubuli, przestrzennie jednorodny wzdłuż skanowanej linii. Szybkość uwalniania SR Ca2+ (ryc. 3g), obliczona na podstawie zmian fluorescencji rod-2 wywołanych przez impulsy depolaryzacyjne o wzrastającej amplitudzie (ryc. 3f), wykazywała podobny przebieg czasowy we włóknach RyR1-Rec jak we włóknach CTRL, ale co ważne, wartości szczytowe były zmniejszone w RyR1-Rec. Dopasowanie szczytowej szybkości uwalniania SR Ca2+ w funkcji napięcia (ryc. 3h- górny wykres) wykazało, że maksymalna szybkość uwalniania Ca2+ była zmniejszona o 25% w grupie RyR1-Rec (ryc. 3i, Max), współczynnik nachylenia (k) był również nieznacznie, ale istotnie zmniejszony, podczas gdy napięcie środkowej aktywacji (V0,5) było niezmienione. Stwierdzono niewielkie (średnio 1,3 ms), ale istotne wydłużenie czasu do szczytu szybkości uwalniania SR Ca2+ we włóknach RyR1-Rec (ryc. 3h, wykres dolny). Nie zaobserwowano zmian w zdolności włókien do usuwania cytozolowego Ca2+ (funkcja pompy SERCA), mierzonej za pomocą wrażliwego na Ca2+ barwnika o niskim powinowactwie fluo-4 FF w warunkach niebuforowania za pomocą AGTA (plik dodatkowy 1: ryc. S3). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te pokazują, że 35% redukcja ilości RyR1 w międzyzrazikowej wiąże się z 30% redukcją prądu wapniowego przez DHPR i 25% redukcją strumienia wapnia przez RyR1.

Zmniejszenie RyR1 wpływa na strukturę mięśni szkieletowych

Aby lepiej zrozumieć podstawę tych funkcjonalnych zmian związanych z obniżeniem RyR1, strukturę mięśni badano na zwierzętach RyR1-Rec w D75 po rekombinacji i porównywano ze zwierzętami CTRL. Extensor digitorum longus (EDL), mięsień szybkokurczliwy, soleus, mięsień wolnokurczliwy i tibialis anterior (TA), mięsień mieszany, analizowano przy użyciu barwień hematoksyliną-eozyną, NADH i trichromem Gomoriego. Barwienia TA, przedstawione na ryc. 4a, wykazały nieprawidłową strukturę mięśnia u zwierząt RyR1-Rec, bez włóknienia i centralnych jąder, ale z zanikiem włókien, obejmującym zarówno włókna typu I, jak i typu II (tab. 2). Dezorganizacja mitochondriów charakteryzująca się lokalnym nagromadzeniem/ubytkiem w sąsiadujących regionach tego samego włókna (grot strzałki i wstawka ryc. 4a) oraz nagromadzenie czerwonego zabarwienia obserwowane za pomocą trichromu Gomoriego (plik dodatkowy 1: Fig. S4), które przypominają rdzenie pyłowe opisywane ostatnio u pacjentów. Zanik włókien obserwowano w obu typach włókien w EDL, chociaż redukcja była nieco bardziej istotna we włóknach typu I (Tabela 2). Przekrój poprzeczny TA myszy CTRL i RyR1-Rec barwiono przeciwciałami przeciwko RyR1 i desminie. Nie zaobserwowano zmian w rozmieszczeniu RyR1 pomiędzy włóknami typu I i typu II w przekrojach TA RyR1-Rec, co wskazuje na podobną redukcję RyR1 we wszystkich typach włókien (ryc. 4b). Zaskakująco ważną modyfikację zaobserwowano w dystrybucji desminy, z ogromnym wzrostem w małych włóknach typu I (ryc. 4b): w przekrojach CTRL TA wszystkie włókna prezentowały podobne barwienie obwodowe, podczas gdy małe włókna typu I w przekrojach RyR1-Rec TA były silnie wybarwione zarówno na obwodzie włókna, jak i w cytozolu (wstawka ryc. 4b). Chociaż znakowanie IF nie jest ilościowe, wyniki te wskazują, że redukcja RyR1 była najprawdopodobniej jednorodna, bez ogromnych różnic między sąsiadującymi włóknami, jak to obserwowano w przypadku desminy, przy czym kwantyfikacja wykonana metodą Western blot jest odbiciem białka zawartego w każdym włóknie, a nie średnią z włókien z 0% RyR1 i włókien ze 100% RyR1 w obrębie tego samego mięśnia.

Organizację triady badano dalej za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego izolowanych włókien EDL (Ryc. 5a). Znakowanie alfa-aktyniny (jako markera linii Z), triadyny i RyR1 (jako markerów triad) na włóknach EDL RyR1-Rec wykazało, że zmniejszenie ilości RyR1 spowodowało uogólnioną dezorganizację włókien z nieprawidłową lokalizacją triad i zaburzeniem linii Z, ale triadyna i RyR1 były nadal częściowo skolokalizowane. Chociaż triady pozostały po obu stronach linii Z, linia Z nie tworzyła linii prostej, jak w CTRL, lecz wykazywała wiele mikrozakłóceń (wstawka ryc. 5a). Ultrastrukturę mięśnia analizowano za pomocą mikroskopii elektronowej na włóknach RyR1-Rec EDL w D75 (ryc. 5b). Niektóre regiony miały względnie zachowaną strukturę (ryc. 5b, lewe włókno), podczas gdy niektóre sąsiednie regiony były silnie zdezorganizowane, z zaburzeniami regularnej organizacji sarkomerów, dezorganizacją mitochondriów i obecnością licznych stosów błon (ryc. 5b, strzałki, powiększone w insercie), zwanych wcześniej triadami wielokrotnymi . Cechy morfologiczne tych wielokrotnych triad w porównaniu z normalnymi pojedynczymi triadami przedstawiono w Tabeli 3, a dodatkowe przykłady przedstawiono w pliku dodatkowym 1: Fig. S5. Dokładna kwantyfikacja putatywnej szerokości T-tubuli, putatywnej szerokości SR i przestrzeni międzybłonowej (T-tubula/SR) (plik dodatkowy 1: Fig. S5) wykazała ogromny wzrost średniego rozmiaru T-tubuli w tych triadach wielokrotnych (dwukrotny wzrost, osiągając 202% rozmiaru T-tubuli w normalnej triadzie), podczas gdy średnia szerokość SR była tylko nieznacznie zwiększona (+ 10%), a przestrzeń międzybłonowa nie została zmodyfikowana. Wyniki te wskazują na uogólnioną dezorganizację strukturalną mięśni myszy RyR1-Rec związaną z przebudową błon.

Zmniejszenie RyR1 wiąże się z modyfikacją ilości licznych białek

Konsekwencje zmniejszenia RyR1 badano na poziomie molekularnym przy użyciu ilościowego Western blot na mięśniu czworogłowym myszy CTRL lub RyR1-Rec myszy (8 zwierząt w każdej grupie) w D75 po iniekcji tamoksyfenu (ryc. 6). Oszacowano względną ilość licznych białek biorących bezpośredni lub pośredni udział w gospodarce wapniowej, stosując jako odniesienie całkowitą ilość białek oznaczoną metodą oceny bezbarwnikowej. Nie zaobserwowano różnicy w ilościowym oznaczaniu RyR1 pomiędzy tą metodą a zastosowaniem łańcucha ciężkiego miozyny jako białka referencyjnego (porównanie ryc. 1, 6). Nie zaobserwowano istotnych zmian pomiędzy mięśniami CRTL i RyR1-Rec w ilości izoformy triadyny T95, białka wiążącego wapń CSQ1, Ca2+-ATPazy SERCA, mitochondrialnej FoF1-ATPazy oraz podjednostki alfa 1 DHPR (ryc. 6a, b). Natomiast zaobserwowano wzrost ilości STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), izoformy triadyny T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004) i ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017). Ponieważ za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego zaobserwowano modyfikację lokalizacji białka strukturalnego desminy (ryc. 5b), określono również ilościowo poziom ekspresji desminy i zaobserwowano ogromny wzrost jej ilości (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). Lokalizację CLIMP63 i STIM1 we włóknach RyR1-Rec EDL analizowano za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego i nie zaobserwowano żadnych istotnych modyfikacji (plik dodatkowy 1: ryc. S6). Zatem redukcja białka RyR1 była związana ze wzrostem różnych białek zaangażowanych w regulację wapnia lub w architekturę mięśni.

Autofagia jest zmieniona w wyniku redukcji RyR1

Zmiany w autofagii zaobserwowano w niektórych miopatiach. W celu zidentyfikowania mechanizmów prowadzących do atrofii mięśni w następstwie redukcji RyR1, szukaliśmy modyfikacji w strumieniu autofagii w mięśniach RyR1-Rec. Ilość LC3 II, białka błonowego autofagosomów, oceniano ilościowo metodą Western blot (ryc. 7a, b) i zaobserwowano wzrost LC3 II (172% ± 32%, p = 0,03). Ten wzrost liczby autofagosomów może odzwierciedlać albo wzrost tworzenia autofagosomów (w wyniku nasilenia procesu autofagii), albo zmniejszenie ich fuzji z lizosomami (a więc zahamowanie degradacji autofagii). Dokładny charakter modyfikacji strumienia autofagii analizowano dalej poprzez ilościowe oznaczenie p62, znanego białka specyficznie degradowanego na drodze autofagii, którego ilość również uległa znacznemu zwiększeniu (ryc. 7a, b, 172% ± 22%, p = 0,006). Związany z tym wzrost LC3 II i p62 w mięśniu RyR1-Rec w porównaniu z kontrolą sugerował, że redukcja RyR1 wiązała się zatem z zahamowaniem strumienia autofagii. Ponadto zaobserwowano wzrost aktywacji (fosforylacji) dwóch inhibitorów autofagii, mTOR i białka S6 (ryc. 7b, c) (wzrost P-mTOR/mTOR o 174% ± 17%, p = 0,01; wzrost P-S6/S6 o 320% ± 50%, p < 0,001). Wzrost fosforylacji tych dwóch inhibitorów autofagii u zwierząt RyR1-Rec w porównaniu do kontroli dodatkowo wskazywał na zahamowanie autofagii odpowiedzialnej za atrofię mięśni u zwierząt RyR1-Rec.

Biopsje pacjentów ludzkich wykazują podobne defekty do tych obserwowanych u myszy RyR1-Rec

W ostatnim badaniu na dużej kohorcie pacjentów z recesywną miopatią wrodzoną , zidentyfikowaliśmy obecność nietypowych struktur, zwanych „rdzeniami pyłowymi”, u ponad połowy pacjentów z redukcją ilości RyR1. Zostały one zaobserwowane przez wielokrotne barwienie i różnią się od klasycznego rdzenia centralnego (dobrze zdefiniowane regiony pozbawione barwnika oksydacyjnego) przez ich słabo zdefiniowane granice, ogniskową dezorganizację miofibryli, czerwono-purpurowe ziarniste odkładanie się materiału przy barwieniu trichromem Gomoriego i mieszanie obszarów o zmniejszonej lub/i zwiększonej aktywności enzymatycznej przy barwieniu oksydacyjnym (Dodatkowy plik 1: Fig. S7). Te zmiany strukturalne odzwierciedlają modyfikacje zaobserwowane w naszym modelu mysim (ryc. 4 i plik dodatkowy 1: ryc. S7). W związku z tym dokonaliśmy dalszego porównania naszego nowego modelu mysiego i biopsji mięśni od pacjentów z obniżoną zawartością białka RyR1 i „zakurzonymi rdzeniami”. Przy użyciu ilościowego Western blot, ilość białek, które zostały wyraźnie zmodyfikowane w naszym modelu mysim, została również oceniona u 5 pacjentów z recesywną chorobą Dusty Core (dwie mutacje RyR1 powodujące redukcję białka RyR1 – ryc. 8a). Jako punkt odniesienia posłużyły biopsje kontrolne w różnym wieku (od 3,5 do 64 lat). U wszystkich pacjentów obserwowano dużą redukcję białka RyR1 (średni poziom ekspresji 19,8% ± 2,2% CTRL, p < 0,001). Obserwowano również wzrost CLIMP63 i desminy. Zmniejszenie RyR1 wiązało się z istotnym wzrostem CLIMP 63 (średni wzrost poziomu ekspresji pięciokrotny, 516% ± 220%). Ponadto, poziom ekspresji desminy był również drastycznie zwiększony u pacjentów w porównaniu z kontrolą (średni wzrost poziomu ekspresji 240-krotny, 24 170% ± 7 635%). Wykorzystując mikroskopię elektronową do analizy ultrastruktury biopsji pacjentów, zaobserwowano wiele stosów błon w regionach zdezorganizowanych (ryc. 8c, strzałki) u wszystkich pacjentów. Regiony te, podobne do stosów obserwowanych w mięśniu RyR1-Rec (ryc. 4b), wskazywały na wspólny mechanizm, zarówno u myszy, jak i u ludzi, prowadzący do powstawania tych struktur w wyniku redukcji RyR1. Przy identycznych modyfikacjach jak u pacjentów z chorobą rdzeni pyłowych, model ten stanowi więc odpowiedni model do badania mechanizmów patofizjologicznych.

.