Fluorescencyjne techniki przeciwciał

By Benedette Cuffari, M.Sc.Reviewed by Emily Henderson, B.Sc.

Od czasu swojego pierwotnego odkrycia w 1942 roku, barwienie immunofluorescencyjne pozostaje wysoce niezawodną i potężną techniką dla szerokiego zakresu badań i celów diagnostycznych.

Komórki białaczki znakowane cząsteczkami fluorescencyjnymi. Image Credit: Vshivkova/.com

Ogólnie, techniki fluorescencji przeciwciał (FA) obejmują wykorzystanie komórek lub przeciwciał, których stały region został oznaczony etykietą fluorescencyjną, inaczej zwaną fluoroforem. Techniki FA są często kategoryzowane jako bezpośrednie lub pośrednie.

Bezpośrednie przeciwciało fluorescencyjne

Bezpośrednia technika przeciwciała fluorescencyjnego, która może być inaczej określana jako bezpośrednia immunofluorescencja (DIF), obejmuje użycie pojedynczego znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała pierwotnego, które jest używane do wiązania się z docelowym antygenem. Przy zastosowaniu klinicznym, DIF jest szczególnie przydatny do szybkiej diagnostyki chorób bakteryjnych, takich jak Streptococcus pyogenes, który jest bardziej znany jako paciorkowiec, jak również zapalenia płuc, które jest wynikiem działania gatunków Mycoplasma pneumoniae i Legionella pneumophilia.

Dla takich celów diagnostycznych, próbka pacjenta jest najpierw umieszczana na szkiełku mikroskopowym, a następnie wystawiana na działanie przeciwciała fluorescencyjnego. Jakiekolwiek wiązanie pomiędzy przeciwciałem znakowanym fluorescencyjnie a docelowym antygenem, którym w tych sytuacjach będą bakterie, spowoduje, że substancje te będą świecić przy badaniu mikroskopem fluorescencyjnym.

Oprócz zastosowania jako narzędzie diagnostyczne, DIF jest również szeroko stosowany w badaniach naukowych. Do takich celów zamrożoną próbkę tkanki, która została pocięta na cienkie odcinki o grubości 5 lub 6 mikrometrów (µm), umieszcza się na szkiełku szklanym.

Slajdy są następnie inkubowane z przeciwciałem znakowanym fluorescencyjnie, które zwykle zawiera panel przeciwciał skierowanych przeciwko izotypom przeciwciał IgA, IgG i IgM wraz z dopełniaczem 3, który jest skierowany przeciwko antygenowi zainteresowania.

Należy pamiętać, że stężenie przeciwciała używanego do tego typu badań będzie oparte na poprzednich eksperymentach, które potwierdziły, które stężenie może osiągnąć najwyższy stosunek sygnału do tła.

Po inkubacji szkiełek przez co najmniej 30 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej, szkiełka są przemywane, a następnie obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Image Credit: anyaivanova/.com

Pośrednie przeciwciało fluorescencyjne

W porównaniu do jednoetapowej techniki stosowanej w DIF, pośrednie IF (IIF) lub pośrednie FA (IFA) jest procesem dwuetapowym, który rozpoczyna się od nałożenia na próbkę nieoznakowanego przeciwciała pierwotnego skierowanego przeciwko antygenowi docelowemu. Drugi etap IIF obejmuje użycie znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowego, które jest skierowane przeciwko części Fc przeciwciała pierwszorzędowego.

Ale IIF jest uważany za bardziej skomplikowany niż DIF, ponieważ jego wykonanie trwa dłużej i wymaga użycia dwóch zgodnych przeciwciał, jest on lepszy pod względem możliwości czułości.

Niektóre wspólne kliniczne zastosowania testów IFA obejmują te używane do diagnozowania kiły. Dla tego typu testu IFA, komórki T. palladium, które zostały wcześniej wyizolowane od zwierzęcia badawczego są izolowane i umieszczane na powierzchni szklanego szkiełka. Surowica uzyskana od pacjenta jest następnie rozprowadzana na komórkach T. palladium, aby umożliwić przeciwciałom antytreponemalnym, jeśli są obecne, związanie się z utrwalonymi antygenami.

Po wypłukaniu próbki surowicy pacjenta, dodawane jest przeciwciało drugorzędowe, które zostało oznaczone fluoroforem. Pozytywny wynik na kiłę oświetli wszystkie kompleksy koniugatu przeciwciała drugorzędowego i fluoroforu.

Innym typem IFA, który jest szeroko stosowany w warunkach klinicznych jest ten, który jest używany do diagnozowania tocznia rumieniowatego układowego (SLE). Pacjenci z SLE, który jest chorobą autoimmunologiczną, będą mieli zwiększony poziom krążących autoprzeciwciał przeciwjądrowych (ANA), które są skierowane zarówno przeciwko DNA, jak i różnym białkom, które wiążą się z DNA.

Dla tego typu testu IFA, komórki są hodowane, a następnie umieszczane na szklanym szkiełku. Każde szkiełko jest następnie inkubowane z innym stężeniem przeciwciała pacjenta, które jest następnie przemywane w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych białek.

Po etapie przemywania do szkiełek dodaje się znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe, które w przypadku testu ANA będzie przeciwciałem antyludzkim IgG, i pozwala się mu inkubować. Miano ANA w surowicy jest następnie uzyskiwane z najwyższego rozcieńczenia surowicy, które wykazało fluorescencję i używane do ustalenia diagnozy SLE.

Cytometria przepływowa

Trzeci typ techniki przeciwciał fluorescencyjnych obejmuje cytometrię przepływową, która jest zautomatyzowanym systemem liczenia komórek, który może być używany do ilościowego określania specyficznych komórek, które są obecne w złożonych mieszaninach, takich jak krew lub surowica.

Typowy eksperyment cytometrii przepływowej rozpocznie się od inkubacji przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie, które jest skierowane przeciwko określonej subpopulacji komórek, takich jak anty-CD4, które może wiązać się z glikoproteiną CD4 znajdującą się na powierzchni różnych komórek odpornościowych, w tym komórek T helper, monocytów i makrofagów. Cytometria przepływowa może również określać ilościowo obecność wielu typów komórek poprzez zastosowanie odpowiednich producentów komórek.

Po zakończeniu inkubacji próbka jest następnie wprowadzana do cytometru przepływowego. W tym urządzeniu, wąska kapilara zmusza komórki obecne w próbce do przemieszczania się w pojedynczym pliku. Gdy komórki przemieszczają się przez kapilarę, laser jest wykorzystywany do aktywacji i wzbudzenia wszystkich komórek, które zostały oznaczone fluoroforem.

Intensywność fluorescencji każdej wzbudzonej komórki jest następnie mierzona przez detektory rozproszenia w przód i w bok i przedstawiana na histogramie do analizy. Oprócz celów kwantyfikacji, zarówno cytometria przepływowa, jak i immunofluorescencja mogą być wykorzystywane do sortowania komórek w oczyszczone subpopulacje do celów badawczych za pomocą techniki znanej jako fluorescencyjnie aktywowany sorter komórkowy (FACS).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Rozdział 20.5 Fluorescencyjne techniki przeciwciał. In: Mikrobiologia. Dostęp z https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). The immunofluorescence techniques in the diagnosis of endocrine autoimmune diseases. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

Further Reading

• All Antibodies Content
• VHH Antibodies (Nanobodies) Advantages and Limitations
• Antibody Selection using DNA Origami Scaffolds
• Uses of Histone Deacetylase (HDAC) Antibodies in Research
• Using Antibodies for Parkinson’s Disease Research

Written by

Benedette Cuffari

Po ukończeniu studiów licencjackich z toksykologii z dwoma minorami z hiszpańskiego i chemii w 2016 roku, Benedette kontynuowała studia, aby ukończyć Master of Science in Toxicology w maju 2018 roku. Podczas studiów magisterskich Benedette badała dermatotoksyczność mechlorethaminy i bendamustyny; dwa środki alkilujące musztardy azotowej, które są stosowane w terapii przeciwnowotworowej.

Cytaty

.