Cele:

1. Różnicowanie pomiędzy dwoma głównymi kategoriami bakterii: Gram dodatnich i Gram ujemnych.
2. Zrozumieć, w jaki sposób reakcja barwna Grama wpływa na bakterie Gram dodatnie i Gram ujemne w oparciu o biochemiczne i strukturalne różnice ich ścian komórkowych.

Kliknij, aby obejrzeć animację

Barwienie jest techniką pomocniczą stosowaną w technikach mikroskopowych wykorzystywaną w celu zwiększenia wyrazistości obrazu mikroskopowego.Barwienia i barwniki są szeroko stosowane w dziedzinie nauki w celu podkreślenia struktury okazów biologicznych, komórek, tkanek itp.

Najpowszechniej stosowaną procedurą barwienia w mikrobiologii jest barwienie metodą Grama, odkryte przez duńskiego naukowca i lekarza Hansa Christiana Joachima Grama w 1884 roku. Barwienie metodą Grama jest techniką barwienia różnicowego, która rozróżnia bakterie na dwie grupy: gram-dodatnie i gram-ujemne. Procedura opiera się na zdolności mikroorganizmów do zatrzymywania koloru barwników używanych podczas reakcji barwienia metodą Grama. Bakterie Gram-ujemne ulegają dekoloryzacji pod wpływem alkoholu, tracąc barwę barwnika podstawowego, fioletowego. Bakterie Gram-dodatnie nie ulegają dekoloryzacji pod wpływem alkoholu i pozostają fioletowe. Po etapie odbarwiania, przeciwbarwnik jest używany do nadania różowego koloru odbarwionym organizmom gram-ujemnym.

Fig: Hans Christian Joachim Gram

Ważność barwienia metodą Grama:

Barwienie metodą Grama jest bardzo ważnym wstępnym krokiem we wstępnej charakterystyce i klasyfikacji bakterii. Jest to również kluczowa procedura w identyfikacji bakterii na podstawie charakterystyki barwienia, umożliwiająca badanie bakterii przy użyciu mikroskopu świetlnego. Bakterie obecne w rozmazie niebarwionym są niewidoczne przy oglądaniu pod mikroskopem świetlnym. Po wybarwieniu, można również obserwować morfologię i rozmieszczenie bakterii. Ponadto, jest to również ważny etap w badaniach przesiewowych czynników zakaźnych w próbkach klinicznych, takich jak bezpośrednie wymazy od pacjenta.

Procedura barwienia metodą Grama umożliwia bakteriom zachowanie koloru plam, w oparciu o różnice w chemicznych i fizycznych właściwościach ściany komórkowej.

1. Bakterie Gram dodatnie: Barwią się na ciemnofioletowo z powodu zatrzymywania w ścianie komórkowej barwnika podstawowego zwanego fioletem krystalicznym.

Przykład: Staphylococcus aureus

Rys: Bakterie Gram dodatnie

2. Bakterie Gram ujemne: Barwią się na czerwono lub różowo z powodu zatrzymania barwnika przeciwbarwnikowego o nazwie Safranina.

Przykład: Escherichia coli

Rys: Bakterie Gram ujemne

Morfologia bakterii:

Bakterie to bardzo małe jednokomórkowe mikroorganizmy wszechobecne w przyrodzie. Są mikrometrów (1µm = 10-6 m) w rozmiarze. Mają ściany komórkowe zbudowane z peptydoglikanu i rozmnażają się przez rozszczepienie binarne. Bakterie różnią się pod względem cech morfologicznych.

Najczęściej spotykane morfologie to:

Coccus (opłucna: Cocci):

Bakterie kuliste; mogą występować w parach (diplokoki), w grupach po cztery (tetrakoki), w gronkowcach (Staphylococci), w łańcuchach (Streptococci) lub w sześciennych układach po osiem lub więcej (sarcinae).

Na przykład: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (opłucna: Bacilli):

Bakterie o kształcie pręcików; na ogół występują pojedynczo, ale mogą sporadycznie występować w parach (diplo-bacilli) lub łańcuchach (streptobacilli).

Na przykład: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (opłucna: Spirilla):

Bakterie o spiralnym kształcie

Na przykład: Spirillum, Vibrio, gatunki Spirochete.

Niektóre bakterie mają inne kształty, takie jak:

Coccobacilli: Wydłużona forma kulista lub jajowata.

Włókniste: Bakterie występujące w długich łańcuchach lub nitkach.

Fusiform: Bakterie o stożkowatych końcach.

Fig: Different bacterial morphology

Gram Stain Mechanism:

Gram Positive Cell Wall:

Bakterie Gram-dodatnie mają grubą siatkowatą ścianę komórkową, która jest zbudowana z peptydoglikanu (50-90% ściany komórkowej), który barwi się na fioletowo. Peptydoglikan jest głównie polisacharydem składającym się z dwóch podjednostek zwanych N-acetyloglukozaminą i N-acetylokwasem muraminowym. W miarę tworzenia się przylegających do siebie warstw peptydoglikanu, są one krzyżowo łączone przez krótkie łańcuchy peptydów za pomocą enzymu transpeptydazy, co nadaje kształt i sztywność ścianie komórkowej. Gruba warstwa peptydoglikanu organizmów Gram-dodatnich umożliwia tym organizmom zatrzymanie kompleksu fioletu krystalicznego z jodem i barwi komórki na fioletowo.

Kwas lipoteichoinowy (LTA) jest kolejnym głównym składnikiem ściany komórkowej bakterii Gram-dodatnich, który jest wbudowany w warstwę peptydoglikanu. Składa się on z kwasów teichoinowych, które są długimi łańcuchami fosforanu rybitolu zakotwiczonymi do dwuwarstwy lipidowej za pośrednictwem glicerydu. Pełni rolę regulatora enzymów autolitycznych ściany (muramidaz: Enzymy bakteryjne zlokalizowane w ścianie komórkowej, które powodują rozpad komórki po urazie lub śmierci.)

Medyczne znaczenie ściany komórkowej bakterii Gram dodatnich:

LTA ma również właściwości antygenowe, które stymulują specyficzne reakcje immunologiczne, gdy jest uwalniany ze ściany komórkowej po śmierci komórki. Śmierć komórki jest spowodowana głównie lizą wywołaną przez aktywność lizozymalną, peptydy kationowe z leukocytów lub antybiotyki beta-laktamowe.

Bakterie Gram-ujemne:

Bakterie Gram-ujemne mają cieńszą warstwę peptydoglikanu (10% ściany komórkowej) i tracą kompleks fioletu krystalicznego z jodem podczas odbarwiania płukanką alkoholową, ale zachowują przeciwbarwnik Safraninę, przez co są czerwonawe lub różowe. Posiadają one również dodatkową błonę zewnętrzną zawierającą lipidy, która jest oddzielona od ściany komórkowej za pomocą przestrzeni peryplazmatycznej.

Medyczne znaczenie ściany komórkowej bakterii Gram ujemnych:

Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych jest często czynnikiem wirulencji, który umożliwia bakteriom patogennym wywoływanie chorób. Zjadliwość bakterii Gram-ujemnych jest często związana z niektórymi składnikami ściany komórkowej, w szczególności z lipopolisacharydem (inaczej znanym jako LPS lub endotoksyna). U ludzi LPS wywołuje wrodzoną odpowiedź immunologiczną, która charakteryzuje się produkcją cytokin i aktywacją układu odpornościowego. W wyniku produkcji cytokin dochodzi do stanu zapalnego, który może również powodować toksyczność dla gospodarza.

Reakcja barwnikowa:

Cztery podstawowe etapy barwienia metodą Grama to:

1) Naniesienie barwnika podstawowego Crystal Violet (CV) na utrwalony termicznie rozmaz hodowli bakteryjnej.

CV dysocjuje w roztworach wodnych na jony CV+ i Cl -. Te dwa jony następnie przenikają przez ścianę komórkową i błonę komórkową zarówno komórek Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych. Jony CV+ oddziałują później z ujemnie naładowanymi składnikami bakteryjnymi i barwią komórki bakteryjne na fioletowo.

2) Dodanie jodyny Grama.

Jod (I – lub I3 -) działa jako zaprawa i jako środek wychwytujący. Zaprawa jest substancją, która zwiększa powinowactwo ściany komórkowej do barwnika poprzez wiązanie się z barwnikiem podstawowym, tworząc w ten sposób nierozpuszczalny kompleks, który zostaje uwięziony w ścianie komórkowej. W reakcji Grama fiolet krystaliczny i jodyna tworzą nierozpuszczalny kompleks (CV-I), który nadaje rozmazowi ciemnopurpurowy kolor. Na tym etapie wszystkie komórki przybierają barwę purpurową.

3) Odbarwianie 95% alkoholem etylowym.

Alkohol lub aceton rozpuszcza lipidową błonę zewnętrzną bakterii Gram ujemnych, pozostawiając odsłoniętą warstwę peptydoglikanu i zwiększa porowatość ściany komórkowej. Kompleks CV-I jest następnie wymywany z cienkiej warstwy peptydoglikanu, pozostawiając bakterie Gram ujemne bezbarwne.

Z drugiej strony, alkohol działa odwadniająco na ściany komórkowe bakterii Gram dodatnich, co powoduje kurczenie się porów ściany komórkowej. Kompleks CV-I zostaje ściśle związany w wielowarstwowej, silnie usieciowanej ścianie komórkowej bakterii Gram dodatnich, przez co komórki zostają zabarwione na fioletowo.

Krok odbarwiania musi być przeprowadzony ostrożnie, w przeciwnym razie może dojść do nadmiernego odbarwienia. Ten krok jest krytyczny i musi być prawidłowo rozłożony w czasie, w przeciwnym razie barwnik fioletu krystalicznego zostanie usunięty z komórek Gram-dodatnich. Jeśli środek odbarwiający zostanie nałożony na komórkę na zbyt długi czas, organizmy Gram-dodatnie staną się Gram-ujemne. Under-decolorization występuje, gdy alkohol nie jest pozostawiony na wystarczająco długo, aby wypłukać kompleks CV-I z komórek Gram-ujemnych, co powoduje, że bakterie Gram-ujemne wydają się Gram-dodatnie.

4) Kontarstain z Safraniną

Odbarwione komórki Gram ujemne można uwidocznić za pomocą odpowiedniego kontarstainu, którym jest zazwyczaj dodatnio naładowana safranina, która barwi je na różowo. Różowy kolor, który przylega do bakterii Gram dodatnich jest maskowany przez purpurę fioletu krystalicznego (w rzadkich sytuacjach zamiast safraniny stosuje się czasem fuschinę podstawową).

.