Liczba kopii metylowanej metylotransferazy O6-Methylguanine-DNA (MGMT) jest określana w stosunku do liczby kopii beta-aktyny (ACTB) za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy specyficznej dla metylacji w czasie rzeczywistym (MSP). W tym celu zawartość tkanki nowotworowej jest wzbogacana przez ręczną mikrodysekcję, po której następuje ekstrakcja DNA. DNA jest kwantyfikowane przy użyciu Picogreen i modyfikowane przez traktowanie bisulfitem, który powoduje, że niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, podczas gdy metylowane cytozyny pozostają niezmienione. Następnie wykonuje się PCR specyficzny dla metylacji (MSP) w czasie rzeczywistym na urządzeniu Quantstudio 5 w celu ilościowego określenia liczby kopii MGMT i ACTB (1). Technika ta polega na przeprowadzeniu PCR z detekcją w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu detekcji amplifluor. Próbki o nieznanej liczbie kopii mogą być określone ilościowo przez porównanie ich wartości Ct z wartościami krzywej wzorcowej plazmidu.
Wskazania kliniczne
MGMT jest enzymem naprawczym DNA, który jest często dezaktywowany przez hipermetylację w ludzkich nowotworach. Kiedy w komórkach brakuje aktywności MGMT, uszkodzenia DNA nie są prawidłowo naprawiane, przez co osobnik jest bardziej podatny na rozwój raka. Co ciekawe, brak aktywności MGMT sprawia również, że komórki nowotworowe są bardziej wrażliwe na radioterapię i niektóre leki alkilujące, takie jak temozolomid (2). W międzynarodowym badaniu prognostycznym III fazy (RTOG 0525), test MGMT z powodzeniem zidentyfikował nowo zdiagnozowanych pacjentów z glejakiem, którzy mają większe szanse na dłuższe życie i dłuższy czas wolny od progresji po leczeniu temozolomidem (3-5). Niedawno ukazała się nowa publikacja, w której zarówno pacjenci zmetylowani, jak i pacjenci z „szarej strefy” uzyskali znacząco lepsze wyniki w zakresie przeżycia całkowitego niż pacjenci prawdziwie niezmetylowani (6).
Wymagania dotyczące próbek
Dopuszczalne próbki do badania to utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie próbki tkanki glejaka o czasie utrwalania 6-48 godzin.
Objętość
Preferowany jest jeden reprezentatywny blok parafinowy. Alternatywnie, akceptowanych jest 5 niebarwionych wycinków tkanki (1 szkiełko o grubości 5 µm do barwienia H&E i minimum 4 szkiełka o grubości 5-10 µm do badania MGMT).
Instrukcje dotyczące przechowywania i wysyłki
Przechowywać i wysyłać próbki w temperaturze otoczenia.
Ograniczenia
W przypadku niektórych próbek, zostanie uzyskany nieważny wynik z powodu niewystarczającej liczby kopii ACTB w połączeniu z liczbą kopii MGMT poniżej granicy wykrywalności. Najczęściej tłumaczy się to niewystarczającą ilością i/lub jakością DNA. Dla nieważnych próbek z liczbą kopii dla MGMT i/lub ACTB w okolicach LOD/LOQ i cut-off, zaleca się wykonanie ponownego testu zaczynając od DNA poddanego działaniu bisulfitu. Środki utrwalające inne niż formalina lub przedłużony czas utrwalania mogą spowodować uzyskanie nieadekwatnych wyników.
Wymagania specjalne
Brak
Czas oczekiwania
Pięć do 7 dni roboczych odpowiednio dla szkiełek i bloczków parafinowych.
- Vlassenbroeck I et al. Validation of Real-Time Methylation-Specific PCR to determine O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Promotor Methylation in Glioma. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-dense temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: a randomized phase III clinical trial.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomide versus standard 6-week radiotherapy versus hypofractionated radiotherapy in patients older than 60 years with glioblastoma: the Nordic randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomide chemotherapy alone versus radiotherapy alone for malignant astrocytoma in the elderly: the NOA-08 randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide. A Pooled Analysis of Four Clinical Trials. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Updated on 23 May 2019
.