INTRODUCTION
Ibuprofen należy do grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NSAID) stosowanych w leczeniu różnych procesów zapalnych, bólu lub gorączki. Mechanizm działania ibuprofenu wynika z hamowania aktywności cyklooksygenazy (COX), która jest niezbędna do syntezy prostaglandyn (PG).1 PG są produkowane z kwasu arachidonowego pochodzącego z błony plazmatycznej, a miejscowe wytwarzanie PG ma działanie podobne do hormonów. W tkankach człowieka występują dwie izoformy COX: konstytutywnie wyrażona izoforma COX-1 występuje w większości tkanek, podczas gdy izoforma COX-2 jest silnie indukowana podczas odpowiedzi zapalnej, w tym w stanach patologicznych przewlekłego zapalenia i raka jelita grubego.2 Spośród różnych produktów pochodnych COX-2, najwyższe stężenia PGE2 występują w nowotworach i wpływają na różne procesy, w tym proliferację i apoptozę komórek.3 W prawidłowej fizjologii PGE2 odgrywa rolę w utrzymaniu prawidłowego stanu błony śluzowej przewodu pokarmowego, regulując takie procesy, jak wydzielanie śluzu i rozszerzanie naczyń krwionośnych.4 Dlatego też długotrwałe leczenie NLPZ może prowadzić do działań niepożądanych, w tym krwawienia z jelit. Większość NLPZ, w tym ibuprofen, hamuje obie izoformy COX.
Udokumentowano, że profilaktyczne stosowanie NLPZ zmniejsza ryzyko zgonu z powodu raka jelita grubego.5-9 Na przykład stosowanie aspiryny w dawce dobowej 300 mg przez okres 10 lat wykazało istotny statystycznie efekt ochronny.7,10,11 Podobne zmniejszenie ryzyka odnotowano przy stosowaniu ibuprofenu w dawce dobowej 200 mg8,11-19 w przypadku różnych typów nowotworów: 51% zmniejszenie ryzyka dla okrężnicy, 72% dla piersi, 62% dla prostaty i 59% dla raka płuc.19
HOW DOES IBUPROFEN PREVENT CANCER?
Gromadzące się dowody ujawniły, że stan zapalny sprzyja nowotworzeniu,20,21 w szczególności, gdy tkanka znajduje się w warunkach przewlekłego stanu zapalnego. W mikrośrodowisku guza komórki zapalne wymieniają sygnały z komórkami nowotworowymi. Komórki zrębu wydzielają czynniki przeżycia dla komórek nowotworowych, podczas gdy komórki nowotworowe produkują cytokiny, które wyzwalają proteolityczną przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej przez komórki zrębu lub tworzenie nowych naczyń krwionośnych.20,22 Ibuprofen hamuje aktywność COX i następczą generację prozapalnych PG; uważa się, że to działanie leży u podstaw chemoprewencyjnego działania ibuprofenu. PGE2, na przykład, aktywuje receptory PGE2 sprzężone z białkiem G, które stymulują różne szlaki sygnalizacyjne zaangażowane w proliferację i przeżycie komórek.23,24
W niniejszym artykule autorzy dokonali przeglądu dodatkowych mechanizmów działania, które są niezależne od hamowania COX-2, w celu zwiększenia świadomości, że kliniczne efekty działania ibuprofenu mogą być pośredniczone przez kilka procesów komórkowych. Przedstawione dowody zostały wyszukane w wyszukiwarce PubMed z użyciem hasła „ibuprofen AND cancer”. Do przeglądu wybrano badania donoszące o efektach niezależnych od COX, w tym badania przeprowadzone w laboratorium autorów.
ADDITIONAL MECHANISMS THROUGH WHICH IBUPROFEN INHIBITS TUMOUR CELLS
W 2015 roku Matos i Jordan25 dokonali przeglądu leczenia komórek nowotworowych za pomocą ibuprofenu. Komórki jelita grubego HCT-116 nie wykazują ekspresji COX-2, ale leczenie ibuprofenem w stężeniu 2 mMol/L wywoływało efekt proapoptotyczny.26 Ibuprofen w niskim stężeniu 100 µMol został następnie zidentyfikowany jako bezpośredni i niezależny od COX ligand receptora gamma aktywowanego proliferatorami peroksysomów (PPARγ),27 i wykazano, że stymuluje jego aktywność jądrową w szczurzych modelach powstawania raka jelita grubego.28 Tak więc działanie proapoptotyczne obserwowane w przypadku ibuprofenu może częściowo wynikać z aktywacji PPARγ, co prowadzi do wyciszenia antyapoptotycznego czynnika transkrypcyjnego NFκB.28
Inna niezależna od COX odpowiedź komórkowa po podaniu ibuprofenu dotyczyła P75NTR, członka nadrodziny receptorów TNF. Poddanie komórek nowotworowych działaniu ibuprofenu w dawce 1 mMol/L spowodowało zależną od szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem p38 stabilizację mRNA p75NTR, prowadząc do zwiększenia poziomu ekspresji29 oraz indukcji apoptozy i zahamowania wzrostu.30
Podobne działanie promujące apoptozę odnotowano w komórkach HCT116, kiedy to stwierdzono, że leczenie ibuprofenem (1,5 mM przez 24 godziny) uwrażliwia te komórki na ligand indukujący apoptozę związany z TNF.31 Podstawowy mechanizm obejmował ekspresję receptora błonowego dla ligandu indukującego apoptozę związanego z TNF: receptora śmierci 5, innego członka nadrodziny receptorów TNF.
Dalej donoszono, że leczenie ibuprofenem (1 mMol/L przez 24 godziny) znacząco zmniejsza jądrowe poziomy β-kateniny w komórkach nowotworów jelita grubego SW480 i DLD-1. Konsekwentnie, ekspresja jednego z jej celów transkrypcyjnych, proproliferacyjnego genu cykliny D1, była tłumiona.32 Chociaż mechanizm leżący u podstaw tego działania pozostaje do ustalenia, ten efekt działania ibuprofenu wydaje się być szczególnie interesujący w profilaktyce raka jelita grubego, ponieważ nadmierna sygnalizacja β-kateniny może powodować niewłaściwą stymulację wzrostu komórek macierzystych błony śluzowej jelita grubego.33
Równolegle do wpływu na sygnalizację β-kateniny, ibuprofen ingerował również bezpośrednio w szlak NFκB. Szybkim efektem leczenia ibuprofenem obserwowanym w komórkach jest hamująca fosforylacja GSK-3β przy serynie 9.32 Stwierdzono, że modyfikacja ta negatywnie reguluje sygnalizację NFκB, na etapie następującym po degradacji jego białka hamującego IkBα, oraz hamuje ekspresję antyapoptotycznych genów docelowych NFκB, takich jak BCL2 i BIRC5.
Inne przykłady niezależnego od COX działania 100 µMol ibuprofenu obejmują hamowanie ekspresji integryn w neutrofilach34 lub indukowane kaspazą uwalnianie cytokin prozapalnych w komórkach HCT-116 i HeLa35.
IBUPROFEN, ALTERNATIE SPLICING, AND CANCER
Komórki nowotworowe różnią się w swoim programie ekspresji genów od odpowiadających im zróżnicowanych komórek prawidłowych. Oprócz regulacji transkrypcji przy promotorach genów, ostatnie 15 lat wyraźnie ujawniło, że alternatywny splicing służy jako istotny mechanizm regulacji ekspresji genów. Na przykład, alternatywny splicing generuje warianty transkryptu, które mogą być niefunkcjonalne i szybko degradowane lub mogą być tłumaczone na izoformy białkowe o różnych, czasami antagonistycznych, właściwościach funkcjonalnych z powodu różnego wykorzystania funkcjonalnych domen białkowych.36,37
Ostatnio zahamowanie alternatywnego wariantu splicingowego RAC1b zostało zidentyfikowane jako kolejne działanie ibuprofenu niezależne od COX.38 Wykazano, że zapalenie jelita grubego jest jednym z czynników wyzwalających zwiększoną ekspresję związanego z nowotworem białka RAC1b, wariantu splicingowego małej GTPazy RAC1. Białko RAC1b zawiera dodatkową domenę kodowaną przez alternatywny ekson o długości 57 par zasad (ekson 3b), który powoduje zwiększoną aktywację białka, tworząc hiperaktywny wariant zdolny do stymulacji sygnalizacji NFκB.39-42 Gdy komórki jelita grubego były traktowane ibuprofenem, ale nie aspiryną lub flurbiprofenem, zarówno poziom mRNA, jak i białka RAC1b był znacznie zmniejszony in vitro i in vivo.38 Podczas gdy w wielu badaniach dotyczących wpływu NLPZ na żywotność komórek nowotworowych stosowano stężenia do 2 mMol/L,43 wpływ ibuprofenu na alternatywny splicing RAC1b obserwowano już przy małych dawkach 100 µMol. Co ciekawe, ibuprofen hamował RAC1b-dodatnie komórki jelita grubego HT29 bardziej niż prawidłowe kolonocyty, a także wpływał na ich wzrost jako podskórnych ksenograftów nowotworowych u myszy. Hamujący efekt ibuprofenu mógł być uratowany, gdy sekwencja cDNA RAC1b niezależna od splicingu została wyrażona w komórce HT29.38 Sugeruje to, że ibuprofen działa bezpośrednio na zdarzenie alternatywnego splicingu.
Inne doniesienie dotyczące modulacji alternatywnego splicingu uzyskano, gdy komórki raka gruczołu krokowego otrzymały skojarzone leczenie ibuprofenem i galusanem epigallokatechiny-3 (EGCG), składnikiem zielonej herbaty o właściwościach przeciwrakotwórczych, który promuje zatrzymanie cyklu komórkowego G0/G1 i apoptozę. W tym przypadku równowaga między anty- i proapoptotycznymi wariantami splicingowymi BCL-X i MCL-1 została przesunięta w kierunku krótszych i proapoptotycznych wariantów BCL-X(S) lub MCL-1(S).44 Chociaż mechanizm ten nie został w pełni zidentyfikowany, obejmuje on aktywację fosfatazy białkowej PP1, o której wiadomo, że deposforyluje białka regulatorowe zaangażowane w splicing pre-mRNA.
MECHANIZM MODULACJI SPLIKANIA PRZEZ IBUPROFEN
Gdy geny kodujące białka ulegają ekspresji w komórkach ludzkich, polimeraza RNA 2 generuje pierwotny transkrypt, pre-mRNA, który zawiera kodujące eksony oddzielone sekwencjami intronowymi. Podczas transkrypcji konserwowane sekwencje nukleotydów wokół każdego połączenia eksonu z intronem są rozpoznawane przez spliceosom, makromolekularną maszynerię składającą się z pięciu małych jądrowych cząsteczek rybonukleoprotein (U1, U2, U4, U5 i U6 – małe jądrowe rybonukleoproteiny),45,46 które następnie usuwają introny w procesie splicingu mRNA. Funkcja spliceosomu jest wspomagana przez elementy wzmacniające lub wyciszające spliceosom, krótkie sekwencje występujące w eksonach lub intronach, które promują lub hamują produktywne rozpoznawanie danego eksonu przez spliceosom. Czynniki splicingowe rozpoznają elementy wzmacniające lub wyciszające spliceosom, które w większości należą do rodziny białek bogatych w serynę i argininę lub heterogennych jądrowych rybonukleoprotein. Często działaj± one antagonistycznie, tak więc modulacja wi±zania zapewnia mechanizm umożliwiaj±cy wł±czenie lub pominięcie alternatywnego eksonu, a tym samym generowanie wariantów transkryptów. W sumie, zestaw czynników splicingowych wyrażonych w danej komórce i ich względne poziomy ekspresji w jądrze komórkowym działają w trybie kombinatorycznym w celu regulacji alternatywnego splicingu.
W przypadku RAC1b alternatywny splicing jest regulowany przez element wzmacniający w eksonie 3b, który jest rozpoznawany przez czynnik splicingowy SRSF1, oraz sąsiedni element tłumiący rozpoznawany przez SRSF3.47
W ludzkich komórkach jelita grubego dostępność SRSF1 w jądrze jest głównym czynnikiem regulującym włączanie lub pomijanie eksonu 3b.48
Jednym z mechanizmów, poprzez który ibuprofen wpływa na alternatywny splicing w komórkach, jest status fosforylacji SRSF1. Frakcjonowanie komórek i eksperymenty immunoblot ujawniły, że leczenie ibuprofenem spowodowało zmniejszenie fosforylacji SRSF1 (dane niepublikowane). Natomiast leczenie aspiryną nie miało takiego wpływu na SRSF1. Pokazało to, że hamujący wpływ ibuprofenu na splicing RAC1b wiązał się z potranslacyjną regulacją subkomórkowej lokalizacji SRSF1.48
Główną kinazą białkową odpowiedzialną za fosforylację SRSF1 jest SRPK1, która znajduje się zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze komórkowym.49,50 Proces ten jest częściowo kontrolowany przez sygnalizację receptora czynnika wzrostu.51 Jak pokazano i opisano na rycinie 1, autorzy zaobserwowali, że leczenie ibuprofenem indukowało translokację SRPK1 z jądra do cytoplazmy, co korelowało ze zmniejszonym poziomem fosforylacji SRSF1 i białka RAC1b wykrywanym w lizatach całych komórek metodą western blot. Takiego efektu nie obserwowano, gdy w tych samych warunkach komórki traktowano aspiryną, co podkreśla COX-niezależne działanie ibuprofenu i specyficzność jego wpływu na modulację czynników splicingowych.