Ez a fejezet homályosan kapcsolódik a 2017-es CICM elsődleges tanterv E(iv) szakaszához, amely elvárja a vizsgázótól, hogy “írja le …az intracelluláris folyadék összetételét”. Mivel ez a szakasz a sejtfiziológiáról szól, a hangsúly itt főként a szervezet mikroszintjén lesz, és az intracelluláris testnedv-kompartiment minden tárgyalása a Testnedvek szakaszra marad.
A tény, hogy a főiskolai vizsgázók soha nem erre a témára irányították a tekintetüket, a tárgyalásnak az értelmetlenség szinte felszabadító levegőjét kölcsönzi, mivel mind a vizsgázók, mind a szerző kellemesen tudatában van annak, hogy mindketten a másik idejét vesztegetik. Ahelyett, hogy a kemény tudományt magunkba szívnánk és a vizsgára alkalmas tényeket memorizálnánk, könnyedén továbbolvashatunk pusztán medutainment okokból, vagy átugorhatunk olyan témákhoz, amelyek több pontot vonzanak.
Összefoglalva:
- A sejtek közötti folyadéktartalomnak van néhány sajátos szerkezeti jellemzője:
- Kis térfogat, átlagosan kb. 2 pikoliter.
- Tömör, tele fehérjékkel (20-30 tömegszázalék fehérje).
- A víz nagy része adszorbeált formában van.
- Ez sajátos funkcionális és kémiai előnyökkel jár:
- Kisebb tér nagy esélyt jelent a molekuláris kölcsönhatásokra.
- A fehérjék makromolekuláris “zsúfoltsága” növeli hőstabilitásukat, növeli a kölcsönhatások affinitását és elősegíti az önszerveződést.
- Az adszorbeált víz atipikus oldószer tulajdonságokkal rendelkezik, amelyek elengedhetetlenek a normál enzimműködéshez.
- Az intracelluláris folyadéknak sajátos kémiai összetétele és tulajdonságai vannak:
- Az intracelluláris folyadékban lévő ionok makromolekulákra adszorbeálódnak és csökkent diffúziós mobilitással rendelkeznek (talán 15%-a annak, ami a szabad oldatból várható lenne)
- Az ionkoncentrációk bármely adott sejtben meglehetősen drámaian változnak (+/- 20mmol) a sejt és a metabolikus állapot függvényében. Nagyjából:
- Na+ 10-30 mmol/L
- K+ 130-150 mmol/L
- Mg2+ 10-20 mmol/L
- Ca2+ közel 0 mmol/L
- Cl- 10-20 mmol/L
- PO4-100-130 mmol/L
- A fehérjék anionos töltése hozzájárul az elektronsemlegességhez
- PH a sejtekben 6 között mozog.0 és 7,5 között, és regionálisan változik a citoszolban
- Noha 20-30%-ban fehérjékből áll, a citoszol a víz viszkozitása.
Melyek az érvényes, lektorált források ehhez a témához? Sajnos számos. Ha valaki egy keresőmotor segítségével vagy egy tankönyv index rovatában rákeres az “intracelluláris folyadék” kifejezésre, elkerülhetetlenül talál egy választ, egy sor bejegyzést vagy oldalt vagy powerpoint-diát, amelyek – bár tartalmukban mind homályosan hasonlóak – idézett értékeikben különböznek, és semmit sem kínálnak hivatkozások formájában. Sokan egyáltalán nem nyújtanak hasznos információkat. Például, ha a témával foglalkozó hivatalos egyetemi könyvekhez fordulunk (Ganong, a 23. kiadás 2. oldala, és Guyton & Hall, a 13. kiadás 4. oldala), azt találjuk, hogy a citoszolikus elektrolitkoncentrációkat olyan kifejezésekkel tárgyalják, mint “nagy mennyiség”. Még a hivatalos bibliográfián kívül az olyan, egyébként szilárd kínálatban, mint a Molecular Biology of the Cell, sincsenek egyenes válaszok. Még abban sem tudnak megegyezni, hogy minek nevezzék (citoszol? Protoplazma? Primordialschlauch?)
Szerencsére még mindig vannak tudósok, akik publikálnak ebben a témában. Valószínűleg a legjobb cikk Katherine Luby-Phelps 1999-es írása, amely alapvetően mindent tartalmaz, amire szükséged lehet ahhoz, hogy válaszolj minden hipotetikus jövőbeli SAQ-ra ebben a témában. Egy másik kiváló, elsősorban a sejten belüli anyag tulajdonságaival foglalkozó bejegyzés Richard P. Sear (2005) rövid írása. Ha valaki igazán őrült, és rendelkezik egy állandó szerződéssel rendelkező személyzeti szakember időforrásával (azaz nincs sürgős kötelezettsége arra, hogy ténylegesen hasznos munkát végezzen), akkor inkább Gilbert Ling In Search of the Physical Basis of Life (1984) című 800 oldalas könyvét fedezheti fel, amelyet egy olyan ember írt, akinek a sejtfiziológiával kapcsolatos publikációi egészen az 1950-es évekig nyúlnak vissza.
Egy sejten belüli tér térfogat
Hogyan nagy egy sejt? Ez nyilvánvalóan a sejttől függ. Jó példa a kiugróra a Xenopus oocita, az afrikai karmos varangy petesejtje, amely 1 mm átmérőjű. Amikor az emberről beszélünk, általában úgy hivatkozunk az intracelluláris folyadékra, mintha az egy viszonylag homogén vödör lenne, de valójában ez a folyadékkompartment körülbelül 1014 apró rekeszből áll, amelyek mindegyike kissé eltérő térfogattal és összetétellel rendelkezik.
Az összes ilyen térfogat heterogenitását jól összefoglalja a BioNumbers adatbázisnak ez a fejezete, ahol mindenféle aprólékosan hivatkozott információ megtalálható. Itt minimális módosítással reprodukáljuk, arra az esetre, ha a Harvard szerverei valaha is összeomlanának.
| Cellatípus | Térfogat (μm3, vagy femtoliter) | Térfogat (pikoliter) | Hivatkozás |
| Sperma sejt | 30 | 0.03 | Gilmore et al, 1995 |
| Erythrocita | 100 | 0.1 | Ballas et al, 1987 |
| Lymphocyta | 130 | 0.13 | Schmid-Schonbein et al, 1980 |
| Neutrofil | 300 | 0.3 | Rosengren et al, 1994 |
| Pankreatikus β-sejt | 1,000 | 1.0 | Finegood et al, 1995 |
| Enterocita | 1,400 | 1.4 | Wiśniewski et al, 2012 |
| Fibroblaszt | 2,000 | 2.0 | Mitsui et al, 1976 |
| Nyaki tumor (HeLa) | 3,000 | 3.0 | Zhao et al, 2008 |
| Hajsejt (fül) | 4,000 | 4.0 | Géléoc et al, 1999 |
| Osteoblaszt | 4,000 | 4.0 | Beck et al, 2011 |
| Alveoláris makrofág | 5,000 | 5.0 | Krombach et al, 1997 |
| Kardiomyocita | 15,000 | 15.0 | Calvillo et al, 2003 |
| Megacaryocita | 30,000 | 30.0 | Harker et al, 2000 |
| Adipocita | 60,000 | 60.0 | Livingston et al, 1984 |
| Oocyta | 4.000.000 | 4000 | Goyanes et al, 1990 |
Ez tehát egy meglehetősen széles tartomány. Ráadásul nyilvánvalóan nem a sejt teljes tartalmát fogja elfoglalni az “intracelluláris folyadék”, függetlenül attól, hogy mi a definíciója ennek a fogalomnak. Például e fejezet alkalmazásában az intracelluláris folyadék definíciója a “sejten belüli tartalom, amely nem organellák” lesz, pusztán azért, mert az organellákat egy másik fejezetben tárgyaljuk. Amiről ebben az esetben beszélünk, az a “szürkés, viszkózus, nyálkás, félig átlátszó és félig folyékony anyag”, amely a többi struktúra közötti intracelluláris teret foglalja el (Harvey, 1937).
Attól függően, hogy milyen sejtet vizsgálunk, ez a tér a teljes térfogatnak nagyon kis hányada lehet. Például a fent említett omentális adipocitában annak a 60 pikoliter össztérfogatnak a túlnyomó többségét vízmentes zsír foglalja el. Ez kísérletileg bizonyítható: DiGirolamo & Owens (1976) ki tudta számítani, hogy a patkányok adipocitáiban a víz térfogata a teljes térfogat 5-7%-a, azaz 1,5-2 pikoliter.
Röviden, nagyon kis térfogatról van szó. Miért fontos ez? Nos. A sejt belső, 1-2 pikoliteres folyadéktérfogata az oldható anyagok eloszlási térfogata. Ezen anyagok molekuláinak tehát nagyon rövid utat kell megtenniük, mielőtt találkoznának egymással. Ennek hatására megnő a reakciók sebessége, ami azért hasznos, mert a reagens molekulák összmennyisége egy ilyen kis térfogat esetében szükségszerűen kicsi. Luby-Phelps (2000) példáját kölcsönözve, ha egy sejt teljes tartalma 1 nanomol egy fehérjéből, ez azt jelenti, hogy a sejtben csak 1000 példány van jelen ebből a fehérjéből. Szerencsére egy ilyen kis térfogatú kötőmolekula még alacsony affinitással is képes lenne a rendelkezésre álló szubsztrát nagy részét felsúrolni és adszorbeálni.
A sejten belüli folyadék fehérjetartalma
Oké, tehát a térfogat kicsi. Milyen makromolekulák vannak benne, és mennyi? Alice B. Fulton (1982) mérlegelte ezt a kérdést a publikált irodalomban talán a legvilágosabb válasszal. Alapvetően a sejtek fehérjetartalma 17 és 35 tömegszázalék között van, a legtöbb szerző a 20-30 g/100 ml közötti tartományba esik. Fulton régi szövegeket idézve (Loewy et al, 1969) a következő értékeket adja meg:
- Az izomsejtek: 23 tömegszázalék fehérje
- Erythrociták: 35 tömegszázalék fehérje
- A legtöbb más sejt: 17-26 tömegszázalék fehérje
A méréseket általában törésmutató méréssel végzik, ami olyan technika, amely általában nem tesz különbséget a strukturális fehérjék (pl. azok, amelyekből a citoszkeleton és az organellák állnak) és az oldható fehérjék között, amelyek a liba többi részét alkotják.
Szóval, mi értelme ennek a vitának? Hát. Ez a fehérjekoncentráció elég magas. A nagyméretű polimerek általában elfogadott koncentrációja felett van, ami várhatóan befolyásolja más hasonló polimerek diffúzióját, azaz túl sűrű az erdő. Chang és munkatársai (1987) készítettek egy matematikai modellt, amely megjósolja, hogy az 50kDa vagy annál nagyobb polimerek esetében ez a diffúziós határ 130g/L körül van, azaz ennél több, és más polimerek nem tudnak könnyen diffundálni az oldatban. Persze, ők benzolban oldott polisztirolt használtak, de a tény nem változik. Összehasonlításképpen, ha egy fehérjét teljesen kikristályosítunk, akkor egy olyan “szilárd anyagot” kapunk, amely csak 40 tömegszázalékban tartalmaz fehérjét
Összefoglalva, a fehérjék az intracelluláris folyadékban olyan szorosan vannak egymáshoz csomagolva, hogy a citoszolt “zsúfolt oldatnak” kell nevezni. Az itt látható karikatúraszerű ábra (amelyet eredetileg Goodsell publikált 1993-ban, és amelyet később gyakorlatilag bárki reprodukált, aki valaha is írt a citoszolról) vizuálisan pontosan szemlélteti, hogy ezek a testek milyen szorosan vannak egymáshoz csomagolva. A rajzot a molekulák ismert méreteivel és alakjaival/elektonmikroszkóppal közelítették, de a SEM-en keresztül készült képek (pl. Bridgman & Reese, 1984) bizonyítják, hogy helyesen ábrázolja a citoszol rendetlen mikroszerkezetét. A Xenopus oocitákat ~ 80 000-es nagyításnál vizsgálva filamentumok és szemcsék sűrű erdeje válik láthatóvá. Az itt látható képet (a 6. ábrájuk egy részét) valójában egy kicsit megtisztították sejtlízissel és mosószeres mosással, hogy eltávolítsák a fehérjetömeg egy részét, amely egyébként eltakarta a finomabb struktúrát. A nyilak a filamentumok Y- és T-csomópontjaira mutatnak.
Mosószeres előkészítés nélkül láthatóvá válik az összes finom szemcsés anyag, amely e filamentumok közé van becsomagolva. A kép most már fehér zajra hasonlít (ugyanazok a szerzők).
Látható, hogy a diffúzió ebben a sűrűben nem lesz normális. A kisebb oldott anyagoknak (pl. az önök nátrium- és káliumionjainak) meg kell kerülniük ezeket a hatalmas akadályokat, a festői utat választva egymás felé. Gyakorlati szempontból ez azt jelenti, hogy minden olyan reakció, amely a diffúzió sebességétől függ, lassabb lesz. Ha a molekuláknak örökké tart eljutni egymáshoz, akkor a kölcsönhatásuk nettó sebességének bizonyára csökkennie kell. Mi azonban nem ezt látjuk.
Milyen kémiai tulajdonságokat látunk ennél az erősen telített fehérjeszerű levesnél? Allen P. Minton (2006) több éves (főként saját) kutatásait foglalta össze a fent hivatkozott tanulmány táblázatában. Itt foglalja össze:
- Az egyébként híg makromolekulák egymáshoz való fokozott kötődési affinitása
- A fehérjetársulások gyorsulása pl. önszerveződés
- Diffúzió-korlátozott reakciók és fehérje társulások lassulása
- A fehérjék stabilizálása hő denaturációval szemben
Összefoglalva, a zsúfoltság a fehérjéket hajtogatásra és kölcsönhatásra kényszeríti, ami olyan komplex konfigurációkat hoz létre, amelyek híg oldatban egyébként lehetetlenek lennének. Wilf & Minton például 1981-ben felfedezte, hogy hígított myoglobin molekulák oldatban kevéssé érdeklődnek egymás iránt, de egy 10%-os oldat (bármilyen!) más fehérje hozzáadásával a myoglobin spontán dimerekké áll össze.
A sejten belüli víz tulajdonságai
Még egy kristályosított fehérjében is csak a tömeg 40%-a tényleges fehérje. A többi oldószer, amely a csomagolt fehérjemolekulák közötti tereket foglalja el (ezek nem pontosan téglalap alakúak, és nem rakódnak szépen egymásra). Ha az oldószer víz, akkor a fele végül a fehérje felületén adszorbeálódik, de a maradékot továbbra is normál folyékony víznek tekinthetjük. Ebben a vékony filmben a sejten belüli víz ionjai oldódnak.
A kötött adszorbeált vízzel nyilván kissé másképp állnak a dolgok. Például ennek a víznek az oldószer-tulajdonságai nem lesznek pontosan ugyanazok, mint a “szabad” vízé. Egyrészt valószínűleg csökkentett kémiai aktivitású lesz. Ahogy az várható volt, a víz “rendezett” állapota számos szokatlan kolligációs tulajdonságot ad neki – Foster és munkatársai (1976) például azt találták, hogy a fagyáspontja lecsökken. Ráadásul a citoszolnak lesznek olyan zsebei, amelyek fokozott aktivitással rendelkeznek (a hidrofil fehérjeszerkezetek körül), és csökkent aktivitással (a hidrofób szerkezetek körül).
Mennyit tartanak a vízből ebben a fogságban a fehérjék? Ezt kissé nehéz megmondani. Ling és munkatársai (1993) kísérletei arra utalnak, hogy a sejtek belsejében a víz nagy része ilyen módon “rendeződik”, de az erről beszámoló kísérletek többségét némileg befolyásolja, hogy az általuk használt nyers élő sejtek különböző homeosztatikus válaszokat adnak a kísérleti körülményekre, ami megzavarja az eredményeket.
A választ általában a sejtek ozmotikus dehidratálásával próbálják megállapítani. Érvelésük szerint, ha ozmotikus nyomást alkalmazunk, akkor az összes “mozgó” víznek ki kell távoznia a sejtből. Ezután megmérik a sejt víztartalmát, és ami megmaradt, annak “mozdulatlannak” kell lennie, a fehérjemolekulák felszínén kell parkolnia, és nem képes vándorolni az ozmotikus nyomás hatására. Cameron és munkatársai (1997) bemutatják azt a (szégyentelenül ellopott és itt balra látható) grafikont, amelyen a megmaradt sejtek víztartalmát ábrázolják a növekvő ozmotikus nyomás x-tengelyén. A nyomás vs. megmaradó víz egyenes, amikor a kísérleti bizonyítékokból extrapolálták és meghosszabbították a “végtelen” ozmotikus nyomás felé, végül az y-tengelyt egy nem nulla ponton keresztezte. Attól függően, hogy milyen sejteket használtunk, ez végül valahol a teljes víztartalom 30-90%-a között volt.
Valójában úgy tűnik, hogy ez a fehérjékre adszorbeálódott víz a sejtek alapvető vize, és az összes “szabad” víz értelmetlen ballaszt. Clegg (1981) néhány szárított sós garnélaráksejt rehidratálásakor azt találta, hogy az anyagcsere-aktivitás újraindult és viszonylag normális volt, amikor a sejtekbe körülbelül 35 tömegszázaléknyi vizet juttattak vissza. vagyis körülbelül annyit, amennyi az összes makromolekula “hidratálásához” szükséges. Ezekben a garnélarákokban szinte biztosan nem volt jelen “ömlesztett fázisú” szabad víz. Persze, nem próbáltak szaporodni vagy RNS-t szintetizálni (ehhez 70-80%-os hidratáltságra volt szükség), de az aminosavak szintézise és a gázcsere viszonylag normálisan folyt. Ez még inkább figyelemre méltóvá teszi azt a tényt, hogy objektív méréskor ennek a sűrű, 20-30%-os fehérje levesnek a viszkozitása nagyon hasonlít a normál vízéhez (Luby-Phelps, 1994)
Intracelluláris folyadék pH
Carter (1972) nagy hatású cikket publikált erről, amelyet gyakran idéznek az emberi élettan tankönyvekben, annak ellenére, hogy a szerző az óriás pajorka (Balanus nubilus) izmait használta, amelyeket egy úgynevezett “pajorka Ringer-oldat”-ban, egy 450 mmol/L nátriumot és 518 mmol/L kloridot tartalmazó sós lében függesztett fel. Aligha lehet az ilyen adatok emberi általánosíthatóságát tisztelve tovább olvasni, de ha mégis megtesszük, akkor felfedezzük a legfontosabb megállapítást: a sejtek pH-ja annyira kompartmentalizálódik, hogy a citoszol különböző régiói vadul eltérő pH-értékekkel rendelkeztek, a 6,0 és 7,5 közötti tartományban.
Intracelluláris elektrolitkoncentrációk
Általában minden tankönyv, amikor az intracelluláris folyadékban lévő elektrolitok koncentrációjára kérdeznek rá, egy ilyen Gamblegrammot fog előállítani (Ling 1984-es könyvéből eltulajdonítva, a hagyatékának vagy a kiadójának engedélye nélkül).
Ez a diagram itt nem hivatkozik Ling könyvében, de azt mondhatnánk, hogy nem is kell, hogy hivatkozzon, tekintve, hogy Ling gyakorlatilag az összes úttörő munkát elvégezte az intracelluláris oldott anyagok viselkedésének meghatározásában. Konkrétan az 1960-as években ő és Ochsenfeld állapították meg, hogy ez a kálium (és az összes többi elektrolit a citoszolban) általában nem szabadon hozzáférhető formában van jelen, hanem a makromolekuláris struktúrákra adszorbeálódva.
A kutatók radioaktívan megjelölt izotópokkal támadták meg a sejteket, és azt találták, hogy ez kevés hatással volt a már ott lévő elektrolitok kiszorítására, ami akkor várható lett volna, ha azok szabadon oszlanak el. Az intracelluláris elektrolitok nagyrészt makromolekulákkal alkotott komplexekben vannak jelen, és sokkal kevésbé mobilak, mint azt egy olyan sejtmodell alapján várnánk, ahol az összes tartalom egy homogén vizes zsákban létezik. Ugyanezek a szerzők (Ling & Ochsenfeld, 1973) később megerősítették, hogy a kálium mobilitása az intracelluláris kompartmentből az extracellulárisba körülbelül egynyolcada annak, ami a szabad oldatban történő egyszerű diffúzióból várható lenne. Az elölt békaizomból valamivel könnyebben szivárgott ki a kálium (a diffúzió sebessége csak 25%-kal csökkent a várthoz képest), mivel az ATP által működtetett pumpák nem működtek tovább, és a fehérjék szerkezete dezorganizálódott.
Egyezzünk meg tehát abban, hogy ezek az ionok nem a szabad intracelluláris víz csobogó tavában oldódnak, hanem komplexekbe kötődve. Ez még mindig nem válaszolja meg a kérdést: mennyi mi van benne? Kiderült, hogy erre viszonylag könnyű válaszolni. Sőt, sokkal könnyebb, mint a fejezetben eddig felvetett bármely más kérdésre. Csupán annyi a dolgunk, hogy fogjuk a citoszolunkat, fagyasztva szárítsuk meg, majd mérjük meg a száraz tömeg elemi összetételét. Mason és munkatársai (1981) pontosan ezt tették néhány vesetubuláris sejt esetében, az iszkémiás sérülés előtt és után. Eredményeiket az alábbiakban reprodukáljuk, mind az eredeti 1981-es táblázat, mind egy szép fényes Gamblegramm formájában:
Amint a káliumkoncentráció vad ingadozásaiból látható, akár 20 perces iszkémiát követően, a sejtek elektrolit-összetétele sokkal folyékonyabb, mint az extracelluláris folyadéké (ahol bármely elektrolit koncentrációjának 20 mmol-os változása rosszul tolerálható lenne, egyfajta egzisztenciális organizmus túlélési szinten). Ráadásul minden sejtvonalnak van valamilyen, kissé eltérő intracelluláris ionkoncentrációja. Ez okozza a tankönyvekben tárgyalt intracelluláris elektrolitértékek pontatlanságát, és azt, hogy általában vonakodnak bármilyen számot megadni. Gyakorlatilag bármilyen számot idéznek, az téves lesz. Például Mason disztális tubulusaiban 11mmol/L nátrium volt a citoszolban, de Poole-Wilson (1975) a bal kamrai szívizomsejtekben körülbelül 44mmol/L-t, a bal négyfejűekben pedig 20mmol/L-t talált. Alam és munkatársai (1977) 25 mmol/L körüli nátrium- és 145 mmol/L körüli kálium-értékeket adnak meg néhány meghibásodott májsejtben. Röviden, bármely adott sejt kusza és kiszámíthatatlan környezete megnehezíti a konkrét számok megadását.