Techniques d’anticorps fluorescents

Par Benedette Cuffari, M.Sc.Révisé par Emily Henderson, B.Sc.

Depuis sa découverte originale en 1942, la coloration par immunofluorescence est restée une technique très fiable et puissante pour un large éventail de recherches et de diagnostics.

Cellules leucémiques marquées avec des molécules fluorescentes. Image Credit : Vshivkova/.com

En général, les techniques d’anticorps fluorescents (FA) impliqueront l’utilisation de cellules ou d’un anticorps, dont la région constante a été marquée avec un marqueur fluorescent autrement connu comme un fluorophore. Les techniques d’AF sont souvent classées comme directes ou indirectes.

Anticorps à fluorescence directe

La technique d’anticorps à fluorescence directe, qui peut autrement être appelée immunofluorescence directe (DIF), implique l’utilisation d’un seul anticorps primaire marqué par fluorescence qui est utilisé pour se lier à un antigène cible. Lorsqu’elle est utilisée en clinique, la DIF est particulièrement utile pour le diagnostic rapide de maladies bactériennes telles que Streptococcus pyogenes, plus communément appelé streptocoque, ainsi que la pneumonie qui est le résultat des espèces Mycoplasma pneumoniae et Legionella pneumophilia.

Pour de tels diagnostics, l’échantillon du patient est d’abord placé sur une lame de microscope puis exposé à l’anticorps fluorescent. Toute liaison entre l’anticorps marqué par fluorescence et l’antigène cible, qui pour ces situations serait des bactéries, fera que ces substances s’illuminent lors de l’examen avec un microscope à fluorescence.

En plus de son utilisation comme outil de diagnostic, le DIF est également largement utilisé pour les études de recherche scientifique. À ces fins, un échantillon de tissu congelé qui a été coupé en sections minces de 5 ou 6 micromètres (µm) est placé sur une lame de verre.

Les lames sont ensuite incubées avec un anticorps marqué par fluorescence, qui comprendra généralement un panel d’anticorps qui sont dirigés contre les isotypes d’anticorps IgA, IgG et IgM ainsi que le complément 3, qui est ciblé contre l’antigène d’intérêt.

Notez que la concentration de l’anticorps utilisé pour ce type d’étude sera basée sur des expériences précédentes qui ont confirmé quelle concentration permet d’obtenir le rapport signal/bruit le plus élevé.

Après que les lames aient été incubées pendant au moins 30 minutes dans l’obscurité et à température ambiante, les lames sont lavées puis imagées avec un microscope à fluorescence.

Crédit image : anyaivanova/.com

Anticorps à fluorescence indirecte

Par rapport à la technique en une seule étape utilisée pour la DIF, l’IF indirecte (IIF) ou l’AF indirecte (IFA) est un processus en deux étapes qui commence par l’application d’un anticorps primaire non marqué sur l’échantillon qui est dirigé contre un antigène cible. La deuxième étape de l’IIF implique l’utilisation d’un anticorps secondaire marqué par fluorescence qui est dirigé contre la partie Fc de l’anticorps primaire.

Bien que l’IIF soit considéré comme plus compliqué que l’IFD, car il est plus long à réaliser et nécessite l’utilisation de deux anticorps compatibles, il est supérieur en termes de capacités de sensibilité.

Certaines applications cliniques courantes des tests IFA incluent celles utilisées pour le diagnostic de la syphilis. Pour ce type de test IFA, les cellules de T. palladium qui ont été préalablement isolées d’un animal de recherche sont isolées et placées sur la surface d’une lame de verre. Un sérum qui a été acquis auprès d’un patient est ensuite étalé sur les cellules T. palladium pour permettre aux anticorps anti-tréponèmes, s’ils sont présents, de se lier aux antigènes fixés.

Après que l’échantillon de sérum du patient ait été lavé, un anticorps secondaire qui a été marqué avec un fluorophore est ajouté. Un résultat positif pour la syphilis illuminera tous les complexes conjugués anticorps secondaire-fluorophore.

Un autre type d’IFA largement utilisé en milieu clinique est celui qui est utilisé pour le diagnostic du lupus érythémateux systémique (LES). Les patients atteints de LED, qui est une maladie auto-immune, auront un niveau accru d’auto-anticorps anti-nucléaires (ANA) circulants qui sont ciblés à la fois contre l’ADN et diverses protéines qui se lient à l’ADN.

Pour ce type de test IFA, les cellules sont cultivées puis placées sur une lame de verre. Chaque lame est ensuite incubée avec une concentration différente de l’anticorps du patient, qui est ensuite lavé pour éliminer les protéines non liées.

Après l’étape de lavage, un anticorps secondaire marqué par fluorescence, qui pour le test ANA sera une IgG antihumaine, est ajouté aux lames et laissé à incuber. Un titre de l’ANA dans le sérum est ensuite obtenu à partir de la plus haute dilution de sérum qui a montré une fluorescence et utilisé pour déterminer un diagnostic de LED.

Cytométrie en flux

Le troisième type de technique d’anticorps fluorescents comprend la cytométrie en flux, qui est un système automatisé de comptage des cellules qui peut être utilisé pour quantifier des cellules spécifiques qui sont présentes dans des mélanges complexes tels que le sang ou le sérum.

Une expérience typique de cytométrie en flux commencera par l’incubation d’un anticorps marqué par fluorescence qui est ciblé contre une sous-population spécifique de cellules, comme l’anti-CD4, qui peut se lier à la glycoprotéine CD4 présente à la surface de diverses cellules immunitaires, y compris les cellules T helper, les monocytes et les macrophages. La cytométrie en flux peut également quantifier la présence de plusieurs types de cellules en utilisant des fabricants de cellules appropriés.

Une fois l’incubation terminée, l’échantillon est ensuite introduit dans le cytomètre en flux. A l’intérieur de cette machine, un capillaire étroit oblige les cellules présentes dans l’échantillon à se déplacer en file indienne. Au fur et à mesure que les cellules se déplacent dans le capillaire, un laser est utilisé pour activer et exciter toutes les cellules qui ont été marquées avec le fluorophore.

L’intensité de fluorescence de chaque cellule excitée est ensuite mesurée par les détecteurs de diffusion avant et latérale et représentée sur un histogramme pour analyse. En dehors des objectifs de quantification, la cytométrie en flux et l’immunofluorescence peuvent toutes deux être utilisées pour trier les cellules en sous-populations purifiées à des fins de recherche par une technique connue sous le nom de trieur de cellules activé par fluorescence (FACS).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Techniques d’immunofluorescence. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Chapitre 20.5 Techniques d’anticorps fluorescents. In : Microbiologie. Accédé à partir de https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). Les techniques d’immunofluorescence dans le diagnostic des maladies auto-immunes endocriniennes. Pleins feux sur l’auto-immunité 3(2) ; 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

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Écrit par

Benedette Cuffari

Après avoir obtenu son baccalauréat en toxicologie avec deux mineurs en espagnol et en chimie en 2016, Benedette a poursuivi ses études pour obtenir son Master of Science en toxicologie en mai 2018. Pendant ses études supérieures, Benedette a étudié la dermatotoxicité de la méchloréthamine et de la bendamustine ; deux agents alkylants à base de moutarde d’azote qui sont utilisés dans les thérapies anticancéreuses.

Dernière mise à jour le 18 mars 2021

Citations

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  Cuffari, Benedette. (2021, 18 mars). Techniques d’anticorps fluorescents. Actualité-Médicale. Récupéré le 25 mars 2021 de https://www.news-medical.net/life-sciences/Fluorescent-Antibody-Techniques.aspx.

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  Cuffari, Benedette. « Techniques d’anticorps fluorescents ». News-Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Fluorescent-Antibody-Techniques.aspx. (consulté le 25 mars 2021).

• Harvard

  Cuffari, Benedette. 2021. Techniques d’anticorps fluorescents. News-Medical, consulté le 25 mars 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/Fluorescent-Antibody-Techniques.aspx.

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