Matériels et méthodes
Participants
Les sujets étaient 83 enfants atteints de TDAH (75% de garçons) et 72 enfants TD (51% de garçons), âgés de 6 à 13 ans. Les critères d’inclusion pour le groupe TDAH étaient les suivants : (a) un diagnostic clinique de TDAH selon les critères du DSM-IV, (b) la confirmation de ce diagnostic par le Diagnostic Interview Schedule for Children, quatrième édition, administré aux parents (DISC-IV-P ; ), (c) symptômes significatifs de TDAH, comme l’indiquent les évaluations des parents >90e percentile sur au moins une des échelles de TDAH (échelles d’inattention et d’hyperactivité/impulsivité) de l’échelle d’évaluation des troubles du comportement (DBDRS ; ), et (d) symptômes envahissants de TDAH, comme l’indiquent les évaluations des enseignants >75e percentile sur au moins une des échelles de TDAH de la DBDRS. Le fait d’avoir un diagnostic comorbide (par exemple TED ou TSA) n’était pas un critère d’exclusion, pas plus que le traitement par des médicaments stimulants. Les enfants sous traitement par stimulants (N = 50, 60% du groupe TDAH) ont cessé de prendre des médicaments 24 heures avant le test, afin de permettre une élimination complète, et pendant leur participation à notre étude. Les critères d’inclusion pour le groupe TD étaient les suivants (a) l’absence de diagnostic clinique de tout trouble du développement ou du comportement (y compris le TDAH et le TOC), et (b) des scores <90e percentile sur les échelles de TDAH évaluées par les parents et l’enseignant du DBDRS.
Matériel
Comportement.
Les parents des enfants éligibles pour l’inclusion dans le groupe TDAH ont été évalués avec la section sur le trouble du comportement perturbateur du DISC-IV-P. Le DISC-IV-P est un entretien diagnostique standardisé largement utilisé pour l’évaluation des troubles psychiatriques de l’enfance du DSM-IV, avec des propriétés psychométriques adéquates.
Les parents et les enseignants des enfants du groupe TDAH et du groupe TD ont rempli le DBDRS pour évaluer les symptômes du TDAH et les symptômes du TOC et du TC. Le DBDRS contient quatre échelles mesurant les symptômes d’inattention, d’hyperactivité/impulsivité, de TOC et de TC sur une échelle de Likert en 4 points (allant de 0 à 3), les scores les plus élevés indiquant des symptômes plus graves. Des propriétés psychométriques adéquates ont été rapportées pour le DBDRS.
Le Strengths and Weaknesses of ADHD-symptoms and Normal Behaviour rating scale (SWAN ; ) a été rempli par les parents et les enseignants pour évaluer les symptômes du TDAH. Ce questionnaire largement utilisé contient deux sous-échelles : l’échelle d’inattention et l’échelle d’hyperactivité/impulsivité, chacune comprenant 9 items. Les items sont notés sur une échelle de Likert en 7 points (allant de -3 à +3), les scores les plus élevés indiquant une aggravation des symptômes. Les items sont basés sur les symptômes du TDAH du DSM-IV, mais reflètent les deux extrémités (forte et faible) du comportement décrit dans chaque symptôme du TDAH. Les scores moyens des deux sous-échelles ont été utilisés comme variables dépendantes. Des propriétés psychométriques adéquates ont été rapportées pour le SWAN.
Les symptômes du TDAH ont été évalués à l’aide de l’échelle de réactivité sociale (SRS ; ) de 65 items, complétée par les parents et les enseignants. Les items de la SRS sont basés sur les domaines de symptômes du DSM-IV des TSA, y compris l’altération de l’interaction sociale, les déficits de communication et les modèles restreints/stéréotypiques de comportements ou d’intérêts. Le SRS utilise une échelle de Likert en 4 points (allant de 0 à 3), et le score total des items de l’échelle SRS totale a été utilisé comme mesure dépendante, les scores les plus élevés indiquant une aggravation des symptômes. Le SRS a des propriétés psychométriques adéquates.
Taches sanguines.
Pour étudier les concentrations sanguines de tryptophane, de tyrosine et de phénylalanine, une technique de taches sanguines séchées a été utilisée. Le prélèvement de taches de sang est moins invasif pour les enfants que la prise de sang veineux et la technique des taches de sang séché est suffisamment robuste et stable à des fins de diagnostic . Les concentrations d’AAA dans le sang sont fortement corrélées aux concentrations d’AAA dans le sérum (rs allant de 0,86 à 0,96). Un échantillon de sang de chaque enfant a été prélevé à l’aide d’une lancette de sécurité jetable. Trois gouttes de sang ont été déposées sur une carte de taches de sang. Un poinçon de 5,5 mm d’une tache de sang séché a été mélangé avec 100μl d’une solution standard interne (contenant 29μM de L-phénylalanine-D5, 6μM de L-tyrosine-D4 et 5μM de L-tryptophane-D5) et 400μl de méthanol dans un flacon de chromatographie en phase gazeuse (flacon GC) et agité pendant 15 minutes dans un bain à ultrasons. Le surnageant a été transféré dans un autre flacon GC et évaporé sous azote à 30°C. Par la suite, l’échantillon a été butylé avec 100μl de chlorure d’acétyle à 5,5% (dans du n-butanol) à 60°C pendant 15 minutes. Ensuite, la couche de butanol a été évaporée sous azote (à 30°C) et le résidu a été dissous dans 500μl d’acétonitrile. Les concentrations de tryptophane, de tyrosine et de phénylalanine dans les taches sanguines ont été déterminées par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide à électrospray positif (LC-MS/MS), à l’aide d’un spectromètre de masse triple quadripôle API 3000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), couplé à un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (Perkin Elmer Series 200, Shelton, USA). Trois μl de l’échantillon ont été injectés sur une colonne symétrique C18 (3,9*150mm, 5μm ; Waters, Milford, MA, USA) et élués avec un débit de 1ml/min d’acétonitrile à 75% (contenant 0,4% d’acide formique). Le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine ont été élués en 1 minute et ont été mesurés à l’aide des transitions : rapport masse/charge (m/z) 261,2→159,2 (tryptophane), m/z 238,2→136,2 (tyrosine) et m/z 222,2→120,2 (phénylalanine). Toutes les données LC-MS/MS obtenues ont été acquises et traitées à l’aide du logiciel Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Les concentrations de tryptophane, de tyrosine et de phénylalanine dans les taches sanguines ont été exprimées en μmole/L. La fiabilité de la LC-MS/MS a été confirmée par l’examen de la variance inter-essai (étant de 5-10%), de la variance intra-essai (étant de 8-10%) et de la récupération (étant de 90-112%).
Apport protéique alimentaire.
L’apport protéique quotidien a été évalué pendant trois jours, en utilisant un journal nutritionnel rapporté par les parents. Des registres et des instructions diététiques standardisés ont été fournis. Les parents ont reçu l’instruction d’enregistrer tous les aliments et boissons consommés dans le registre diététique et d’exprimer les quantités consommées aussi précisément que possible. La quantité de protéines consommées (grammes/jour) a été calculée à partir d’une version informatisée de la base de données néerlandaise sur la composition des aliments. La base de données néerlandaise sur la composition des aliments contient plus de 2000 produits alimentaires avec des informations sur la composition nutritionnelle de ces produits. La base de données est largement utilisée à des fins scientifiques (par exemple).
Urine.
Afin d’examiner les concentrations urinaires d’AAA, les participants ont recueilli toute l’urine excrétée au cours de 18 heures consécutives (après les heures de classe) dans un récipient de collecte d’urine. Pendant la collecte de l’urine, le récipient a été conservé dans un réfrigérateur (<5°C). Un échantillon de 10 ml a été envoyé à un laboratoire pour analyse, où l’échantillon a été conservé à -20°C. Une technique HPLC avec détection de fluorescence a été utilisée pour l’analyse du tryptophane dans l’urine . Les concentrations de tyrosine et de phénylalanine dans l’urine ont été déterminées à l’aide d’un analyseur d’acides aminés Biochrom . Les concentrations urinaires de tryptophane, de tyrosine et de phénylalanine ont été exprimées par un rapport μmole sur volume total d’urine, afin d’exclure les effets de la polyurie ou de l’oligurie. La fiabilité de la technique HPLC a été confirmée par l’examen de la précision des analyses, soit 2,25 % pour le tryptophane (écart-type relatif), et 1,50 % pour la tyrosine et la phénylalanine. Il existe des corrélations élevées entre les concentrations d’acides aminés dans les échantillons de 12 heures et les échantillons de 24 heures , indiquant qu’il n’y a pas de variation diurne dans l’excrétion des acides aminés, validant l’utilisation d’un échantillon de 18 heures dans l’étude actuelle.
Procédure
Cette étude a reçu l’approbation du comité local d’éthique médicale du centre médical universitaire VU d’Amsterdam, aux Pays-Bas (#NL39922.029.12), et a été réalisée conformément aux normes éthiques telles que définies dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs. Le consentement éclairé écrit a été obtenu des parents de tous les enfants, et des enfants ≥12 ans, avant la participation. Les enfants atteints de TDAH ont été recrutés dans des cliniques externes de santé mentale, par l’intermédiaire de l’association parentale pour les enfants ayant des problèmes de comportement, et par le biais d’un site Web de recherche universitaire. Le groupe TD a été recruté dans des écoles primaires situées dans tout le pays. Les enfants qui prenaient des stimulants ont cessé d’en prendre un jour avant la participation (jour 0), afin de garantir une élimination complète, et pendant l’évaluation de la prise de sang, d’urine et de nourriture (jour 1 à jour 3). Le jour 1, la prise de sang a été effectuée tôt le matin, afin d’exclure les effets de la variation diurne des concentrations sanguines d’AAA. Le même jour, après l’heure de l’école, la collecte d’urine a commencé et s’est poursuivie pendant les 18 heures suivantes, jusqu’à ce que l’enfant retourne à l’école le lendemain matin (jour 2). Tôt le matin du jour 1, les parents ont reçu des instructions détaillées sur la façon de remplir le carnet alimentaire et de recueillir l’urine de leur enfant. Après cette instruction, les parents ont commencé à noter les apports alimentaires de leur enfant, ce qu’ils ont fait pendant les trois jours suivants (jour 1 à jour 3). Les parents et les enseignants étaient invités à remplir les questionnaires sur un site internet sécurisé. Toutes les données ont été recueillies entre février 2013 et juillet 2014. Le groupe TDAH et le groupe TD ont été recrutés simultanément, afin de contrôler les éventuels effets saisonniers sur la prise alimentaire ou le métabolisme de l’AAA.
Analyse des données
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec R, version 3.2.1. Toutes les variables ont été inspectées sur les valeurs aberrantes et les valeurs manquantes pour le groupe TDAH et TD séparément. La méthode de Winsorisation a été appliquée aux valeurs aberrantes, celles-ci ont été remplacées par une valeur supérieure (ou inférieure) d’une unité au score le plus extrême précédent dans la distribution du groupe. Les données manquantes dans les concentrations urinaires, les données alimentaires et les données comportementales ont été réparties de manière aléatoire et remplacées par les moyennes du groupe. Pour les taches de sang, il n’y avait pas de données manquantes. Toutes les données étaient normalement distribuées, à l’exception des symptômes de la MC. Les différences de groupe en termes de sexe ont été examinées à l’aide d’un test du chi carré, et les différences de groupe en termes d’âge et de fonctionnement comportemental ont été examinées à l’aide de tests t d’échantillons indépendants.
Pour tester la première hypothèse, les différences de groupe dans les concentrations de taches sanguines d’AAA ont été évaluées à l’aide d’analyses de variance (ANOVA) avec le groupe (TDAH ou TD) comme facteur fixe. Les tailles d’effet ont été calculées en termes d’êta carré partiel et interprétées comme étant petites (> 0,01), moyennes (> 0,06) ou grandes (> 0,14). En outre, des rapports de cotes ont été calculés, qui expriment le risque d’être diagnostiqué comme souffrant de TDAH avec des concentrations d’AAA inférieures à la moyenne. Les données normatives pour les concentrations d’AAA proviennent d’un large échantillon d’enfants âgés de 6 à 13 ans (N = 104, 52% de garçons) (données non publiées, informations sur l’échantillon et résultats disponibles auprès des auteurs). Pour chaque AAA, les concentrations correspondant au 16e percentile le plus bas (M-1 SD) de l’échantillon normatif ont été utilisées comme valeur seuil pour définir les concentrations d’AAA inférieures à la moyenne (pour le tryptophane 45 μmole/L, la tyrosine 39 μmole/L et la phénylalanine 47 μmole/L). Les rapports de cotes ont été calculés avec leur intervalle de confiance à 95 % et le test exact de Fisher a été effectué pour examiner la signification des rapports de cotes.
Pour tester la deuxième hypothèse, les coefficients de corrélation produit-moment de Pearson ont étudié la relation entre les concentrations d’AAA dans le sang et les symptômes du TDAH évalués par les parents et les enseignants. La magnitude des coefficients de corrélation a été interprétée comme étant petite (>.10), moyenne (>.30) ou grande (>.50) . Les données du groupe TDAH et du groupe TD ont été combinées pour maximiser la variabilité des mesures des symptômes du TDAH.
Pour tester la troisième hypothèse, des analyses de corrélation entre les concentrations sanguines d’AAA et l’ingestion de protéines et les concentrations urinaires d’AAA ont été réalisées dans l’ensemble de l’échantillon. Nous avons également examiné s’il existait des différences de groupe dans l’ingestion de protéines et les concentrations urinaires d’AAA en utilisant des ANOVA avec le groupe (TDAH ou TD) comme facteur fixe. Enfin, des analyses corrélationnelles ont permis de déterminer si les concentrations sanguines d’AAA étaient liées aux symptômes de troubles psychiatriques comorbides signalés par les parents et les enseignants (coefficients de corrélation du produit-moment de Pearson pour les TOC et les TSA, coefficients de corrélation du rang de Spearman pour les TC). S’il s’avérait que les symptômes de TOC, de TC ou de TSA étaient liés aux concentrations d’AAA, les analyses précédentes ont été refaites en intégrant ces symptômes comme covariables. Afin de corriger les tests multiples, le niveau alpha des analyses de corrélation a été ajusté selon la procédure de Bonferroni par domaine de résultat : symptômes de TDAH (12 analyses, donc p = 0,004), déterminants potentiels des anomalies de l’AAA dans les taches sanguines (12 analyses, donc p = 0,004), et symptômes de troubles psychiatriques comorbides (18 analyses, donc p = 0,003). Les résultats ajustés par Bonferroni sont rapportés.