Objectifs :

1. Différencier les deux grandes catégories de bactéries : Gram positif et Gram négatif.
2. Comprendre comment la réaction de coloration de Gram affecte les bactéries Gram positif et Gram négatif en fonction des différences biochimiques et structurelles de leurs parois cellulaires.

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La coloration est une technique auxiliaire utilisée dans les techniques microscopiques utilisées pour améliorer la clarté de l’image microscopique.Les taches et les colorants sont largement utilisés dans le domaine scientifique pour mettre en évidence la structure des spécimens biologiques, des cellules, des tissus, etc.

La procédure de coloration la plus utilisée en microbiologie est la coloration de Gram, découverte par le scientifique et médecin danois Hans Christian Joachim Gram en 1884. La coloration de Gram est une technique de coloration différentielle qui différencie les bactéries en deux groupes : les gram-positives et les gram-négatives. La procédure est basée sur la capacité des micro-organismes à retenir la couleur des colorants utilisés lors de la réaction de coloration de Gram. Les bactéries gram-négatives sont décolorées par l’alcool et perdent la couleur de la coloration primaire, le violet. Les bactéries à Gram positif ne sont pas décolorées par l’alcool et restent violettes. Après l’étape de décoloration, un contre-colorant est utilisé pour donner une couleur rose aux organismes gram-négatifs décolorés.

Fig : Hans Christian Joachim Gram

Importance d’une coloration de Gram:

La coloration de Gram est une étape préliminaire très importante dans la caractérisation initiale et la classification des bactéries. C’est également une procédure clé dans l’identification des bactéries basée sur les caractéristiques de coloration, permettant d’examiner les bactéries à l’aide d’un microscope optique. Les bactéries présentes dans un frottis non coloré sont invisibles lorsqu’on les examine au microscope optique. Une fois colorées, la morphologie et la disposition des bactéries peuvent également être observées. En outre, il s’agit également d’une étape importante dans le dépistage des agents infectieux dans les spécimens cliniques tels que les frottis directs d’un patient.

La procédure de coloration de Gram permet aux bactéries de retenir la couleur des colorants, sur la base des différences dans les propriétés chimiques et physiques de la paroi cellulaire.

1. Bactéries à Gram positif : Se colorent en violet foncé en raison de la rétention du colorant primaire appelé Crystal Violet dans la paroi cellulaire.

Exemple : Staphylococcus aureus

Fig : Bactéries à Gram positif

2. Bactéries à Gram négatif : Se colorent en rouge ou en rose en raison de la rétention du colorant de contre-coloration appelé Safranin.

Exemple : Escherichia coli

Fig : Bactéries à Gram négatif

Morphologie bactérienne:

Les bactéries sont de très petits micro-organismes unicellulaires omniprésents dans la nature. Leur taille est de l’ordre du micromètre (1µm = 10-6 m). Elles possèdent une paroi cellulaire composée de peptidoglycane et se reproduisent par fission binaire. Les bactéries varient dans leurs caractéristiques morphologiques.

Les morphologies les plus courantes sont :

Coccus (pleural : Cocci) :

Bactéries sphériques ; peuvent se présenter en paires (diplococci), en groupes de quatre (tétracocci), en grappes en forme de raisin (staphylocoques), en chaînes (streptocoques) ou en arrangements cubiques de huit ou plus (sarcinae).

Par exemple : Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleural : Bacilli):

Bactéries en forme de bâtonnet ; se présentent généralement seules, mais peuvent parfois se trouver en paires (diplo-bacilli) ou en chaînes (streptobacilli).

Par exemple : Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleural : Spirilla):

Bactéries en forme de spirale

Par exemple : Spirillum, Vibrio, espèces spirochètes.

Certaines bactéries ont d’autres formes telles que :

Coccobacilles : Forme sphérique ou ovoïde allongée.

Filamenteux : Bacilles qui se présentent en longues chaînes ou fils.

Fusiformes : Bacilles dont les extrémités sont effilées.

Fig : Différentes morphologies bactériennes

Mécanisme de coloration par graphe :

Gramme positif de la paroi cellulaire :

Les bactéries gram-positives ont une paroi cellulaire épaisse en forme de maille qui est constituée de peptidoglycane (50-90% de la paroi cellulaire), qui se colore en violet. Le peptidoglycane est principalement un polysaccharide composé de deux sous-unités appelées N-acétyl glucosamine et N-acétyl acide muramique. Lorsque les couches adjacentes de peptidoglycane se forment, elles sont réticulées par de courtes chaînes de peptides au moyen d’une enzyme transpeptidase, ce qui donne la forme et la rigidité de la paroi cellulaire. L’épaisse couche de peptidoglycane des organismes à Gram positif permet à ces organismes de retenir le complexe cristal violet-iode et colore les cellules en violet.

L’acide lipoteichoïque (ALT) est un autre constituant majeur de la paroi cellulaire des bactéries à Gram positif qui est incorporé dans la couche de peptidoglycane. Il est constitué d’acides teichoïques qui sont de longues chaînes de phosphate de ribitol ancrées à la bicouche lipidique par un glycéride. Il agit comme régulateur des enzymes autolytiques de la paroi (muramidases : Enzymes bactériennes situées dans la paroi cellulaire qui provoquent la désintégration de la cellule suite à une blessure ou à la mort.)

Pertinence médicale de la paroi cellulaire à Gram positif:

LTA possède également des propriétés antigéniques qui stimulent des réponses immunitaires spécifiques lorsqu’elle est libérée de la paroi cellulaire après la mort cellulaire. La mort cellulaire est mailnément due à la lyse induite par les activités lysozymales, les peptides cationiques des leucocytes ou les antibiotiques bêta-lactames.

Paroi cellulaire Gram négatif:

Les bactéries Gram négatif ont une couche plus mince de peptidoglycane (10% de la paroi cellulaire) et perdent le complexe cristal violet-iode lors de la décoloration avec le rinçage à l’alcool, mais conservent la contre-coloration Safranin, apparaissant ainsi rougeâtre ou rose. Ils possèdent également une membrane externe supplémentaire qui contient des lipides et qui est séparée de la paroi cellulaire par un espace périplasmique.

Pertinence médicale de la paroi cellulaire des Gram négatifs:

La paroi cellulaire des bactéries Gram négatifs est souvent un facteur de virulence qui permet aux bactéries pathogènes de provoquer des maladies. La virulence des bactéries Gram-négatives est souvent associée à certains composants de la paroi cellulaire, en particulier le lipopolysaccharide ( autrement appelé LPS ou endotoxine). Chez l’homme, le LPS déclenche une réponse immunitaire innée caractérisée par la production de cytokines et l’activation du système immunitaire. L’inflammation se produit à la suite de la production de cytokines, ce qui peut également produire une toxicité pour l’hôte.

Réaction de la souillure :

Les quatre étapes de base de la coloration de Gram sont :

1) Application du colorant primaire Violet de cristal (CV) sur un frottis de culture bactérienne fixé à la chaleur.

Le CV se dissocie dans les solutions aqueuses en ions CV+ et Cl -. Ces deux ions pénètrent ensuite à travers la paroi et la membrane cellulaires des cellules Gram-positives et Gram-négatives. Les ions CV+ interagissent ensuite avec les composants bactériens chargés négativement et colorent les cellules bactériennes en violet.

2) Ajout d’iode de Gram.

L’iode (I – ou I3 -) agit comme un mordant et comme un agent de piégeage. Un mordant est une substance qui augmente l’affinité de la paroi cellulaire pour une coloration en se liant à la coloration primaire, formant ainsi un complexe insoluble qui reste piégé dans la paroi cellulaire. Dans la réaction de la coloration de Gram, le cristal violet et l’iode forment un complexe insoluble (CV-I) qui sert à donner au frottis une couleur violet foncé. A ce stade, toutes les cellules deviennent violettes.

3) Décoloration avec de l’alcool éthylique à 95%.

L’alcool ou l’acétone dissout la membrane externe lipidique des bactéries Gram négatives, laissant ainsi la couche de peptidoglycane exposée et augmentant la porosité de la paroi cellulaire. Le complexe CV-I est alors éliminé par lavage de la fine couche de peptidoglycane, laissant les bactéries Gram négatives incolores.

D’autre part, l’alcool a un effet déshydratant sur les parois cellulaires des bactéries Gram positives, ce qui entraîne un rétrécissement des pores de la paroi cellulaire. Le complexe CV-I se lie étroitement à la paroi cellulaire Gram positive multicouche et hautement réticulée, colorant ainsi les cellules en violet.

L’étape de décoloration doit être réalisée avec soin, sinon une sur-décoloration peut se produire. Cette étape est critique et doit être chronométrée correctement, sinon la coloration au cristal violet sera éliminée des cellules à Gram positif. Si l’agent décolorant est appliqué sur la cellule pendant trop longtemps, les organismes à Gram positif apparaîtront à Gram négatif. La sous-décoloration se produit lorsque l’alcool n’est pas laissé assez longtemps pour éliminer par lavage le complexe CV-I des cellules Gram-négatives, ce qui fait que les bactéries Gram-négatives apparaissent Gram-positives.

4) Contre-coloration avec la safranine

Les cellules Gram-négatives décolorées peuvent être rendues visibles avec une contre-coloration appropriée, qui est généralement la safranine chargée positivement, qui les colore en rose. La couleur rose qui adhère aux bactéries à Gram positif est masquée par le violet du cristal violet (la fuschine basique est parfois utilisée à la place de la safranine dans de rares situations).

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