Mécanisme de dépolymérisation synergique de l’extrémité pointue des filaments d’actine par la protéine associée à la cyclase et la cofiline

Constructions d’ADN

Toutes les protéines N-CAP de souris, N-CAP-GFP, CAP1 pleine longueur, le domaine HFD, la fusion GST du domaine HFD et le domaine ADF-H C-terminal de la twinfiline, ont été clonées dans le vecteur d’expression bactérien pSUMOck4 (un don aimable de Inari Kursula, Université de Bergen, Norvège) pour exprimer une protéine de fusion étiquetée SUMO qui laisse un N-terminal natif après clivage avec la protéase SENP2. Pour les constructions du domaine CARP et du C-CAP, nous avons utilisé le vecteur d’expression bactérien pCoofy18 (un don de Addgene). Pour les détails des constructions protéiques et des amorces utilisées pour le clonage des constructions, voir le tableau supplémentaire 2.

Expression et purification des protéines CAP et de ses fragments

Toutes les protéines CAP de souris et ses fragments, à l’exception de CAP1 pleine longueur, ont été exprimées à +22 °C dans un milieu d’auto-induction LB (AIMLB0210, Formedium) pendant 24 h dans BL21(DE3) E. coli (de Novagen).

Le CAP1 de souris de pleine longueur a été exprimé dans le milieu LB en utilisant des cellules E. coli ArcticExpress (DE3). Tout d’abord, nous avons inoculé une culture de démarrage contenant de la kanamycine (20 µg/ml) et de la gentamycine (20 µg/ml) qui a été incubée pendant 6 h à +37 °C. La culture principale de 3,6 l, contenant uniquement de la kanamycine (20 µg/ml), a été inoculée et cultivée jusqu’à une OD600 de ~0,4 à +37 °C en agitant à 240 rpm. La température de culture a été modifiée à +13 °C pendant 1 h avant l’expression des protéines qui a été induite par l’ajout de 0,26 mM d’IPTG pendant 46 h. Tous les culots bactériens ont été recueillis par centrifugation, remis en suspension dans 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 25 mM d’imidazole, pH 7,5, congelés instantanément avec du N2 liquide et stockés à -80 °C.

Toutes les protéines CAP et le domaine ADF-H de la twinfiline ont été purifiés en utilisant un flux de travail similaire. Tout d’abord, les bactéries ont été lysées par sonication en présence de lysozyme (0,5 mg/ml), de DNAse (0,1 mg/ml) et d’inhibiteurs de protéase (200 µg/ml de PMSF, 1 µg/ml de leupeptine, 1 µg/ml d’aprotinine, 1 µg/ml de pepstatine A ; tous de Sigma-Aldrich), et le lysat a été clarifié par centrifugation. Le surnageant a été chargé dans une colonne HisTrap HP Ni-NTA de 1 ml (GE Healthcare) et lavé abondamment (>20 volumes de colonne) avec 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazole, pH 7,5. Les protéines ont été éluées par un gradient d’imidazole 25-250 mM sur une machine AKTA Pure (GE Healthcare). Les fractions de pointe ont été regroupées et la protéase SENP2 a été ajoutée à une concentration finale de 40 µg/ml pour éliminer l’étiquette SUMO. Le mélange a été dialysé O/N à 4 °C en utilisant le tube de dialyse SnakeSkin dans 1 l de tampon 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7.4. Le lendemain, les étiquettes SUMO clivées ont été éliminées avec des billes d’agarose Ni-NTA (Qiagen) dans les cas où l’étiquette SUMO et la protéine clivée étaient de taille égale. Les protéines ont été concentrées avec un filtre centrifuge Amicon Ultra-4 10 kDa (Merck) et chargées dans une colonne de filtration sur gel HiLoad 16/600 Superdex 200 (GE Healthcare) équilibrée dans 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4. Les fractions de pointe ont été collectées, concentrées et congelées par surgélation dans N2 pour un stockage à -80 °C.

Le CAP complet a été purifié avec les exceptions suivantes. Nous avons utilisé une colonne HisTrap HP Ni-NTA de 5 ml au lieu d’une colonne de 1 ml. Après dialyse et filtration sur gel avec la colonne de filtration sur gel HiLoad 16/60 Superdex 200, les fractions de pics majeurs ont été passées sur la colonne de filtration sur gel Superose 6 increase 10/300 GL pour obtenir une meilleure séparation du mélange d’états oligomériques. Enfin, les pics principaux de plusieurs passages ont été combinés, concentrés à des intervalles de rotation de 5 minutes en utilisant un filtre centrifuge Amicon Ultra-4 30 kDa, et stockés comme ci-dessus. Les protéines CARP et C-CAP ont été purifiées comme ci-dessus, à l’exception de l’utilisation de la protéase 3C (0,01 mg/ml) pour le clivage du tag.

Autres protéines

L’actine musculaire de lapin, les actines marquées, la profiline, la cofiline-1 de souris, la protéine de coiffage et la biotine-gelsoline ont été préparées comme décrit dans la réf. 16. L’ADP-actine a été préparée comme décrit dans la réf. 34. En bref, une solution d’ATP-G-actine de 30 µM contenant 0,3 mM de glucose et 1 unité/ml d’hexokinase (Sigma) a été dialysée contre un tampon d’échange de nucléotides (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) pendant 4 h à 4 °C. Toutes les expériences ont été effectuées en utilisant α-actine musculaire de lapin.

Actine extrémité pointue essais de dépolymérisation

Mesure du taux de dépolymérisation extrémité pointue filament d’actine a été effectuée à l’aide d’un dispositif microfluidique jumelé à une installation de microscopie, comme décrit16. En bref, nous avons préparé une chambre avec du poly diméthyl siloxane (PDMS, Sylgard), qui a été monté sur une lamelle couvre-objet nettoyée. Les chambres microfluidiques avaient une hauteur de 20 µm. Les trois entrées et la sortie étaient reliées à des tubes à pression contrôlée remplis de solutions de composition biochimique différente (dispositif microfluidique Fluigent).

Après montage, les chambres ont été rincées avec du dH20 et du tampon F (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT et 1 mM DABCO). La chambre a ensuite été exposée successivement à : 150 µl de biotine-BSA à 0,1% dans le tampon F ; 300 µl de BSA à 5% ; 150 µl de neutravidine à 3 µg/ml dans le tampon F ; et 10-100 µl de biotine-gelsoline à 1-3 pM. Avant les expériences, les filaments d’actine ont été polymérisés (8 µM, >30 min) dans le tampon F. Une fraction des monomères d’actine a été prélevée pour être utilisée dans les expériences. Une fraction des monomères d’actine a été marquée avec Alexa-488 ou 568. Les filaments ont finalement été injectés dans la chambre et ancrés au couvre-objet par les gelsolines jusqu’à la densité désirée.

Pour mesurer le taux de dépolymérisation des extrémités pointues décorées de cofiline, les filaments ont d’abord été saturés avec 2 µM de cofiline, puis exposés à 2 µM de cofiline complétée par différentes protéines CAP. Le taux de dépolymérisation a été analysé avec ImageJ, en réalisant d’abord un kymographe pour chaque filament (fonction reslice) et en ajustant manuellement une pente le long de l’extrémité pointue. Les filaments, dont les extrémités pointues ne pouvaient pas être clairement suivies ou qui présentaient d’éventuelles pauses (non)observées53 ou des événements de sectionnement ont été écartés de l’analyse.

Pour minimiser l’effet du marquage de la protéine sur nos mesures, nous avons utilisé une fraction de marquage de l’actine de 10% ou de 16% selon la configuration de la microscopie. Nous n’avons pas observé d’effets de la fraction de marquage pour l’activité N-CAP dans nos expériences. Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante, dans une configuration non contrôlée par la température.

Réannexion des filaments d’actine

Des solutions de F-actine préformées et stables (dans le tampon F) avec différents marqueurs fluorescents ont été mélangées et incubées afin de quantifier la réannexion. La solution mélangée contenait 4 µM d’Alexa568-actine (marquée à 10%) et 4 µM d’Alexa488-actine (marquée à 10%), avec ou sans N-CAP et mutants. Après 4 min à température ambiante, la solution de F-actine mélangée a été diluée 100× dans un tampon complété par 0,2% de méthylcellulose, et a coulé dans une chambre ouverte faite avec du ruban adhésif double face pris en sandwich entre deux lamelles, et passivée avec de la BSA. Des séries d’images (intervalle de 2 s) ont été acquises dans au moins trois champs de vision différents. Le nombre de segments de F-actine verts (Alexa488) a été compté, ainsi que le nombre de ces segments qui étaient connectés à un segment de F-actine rouge (Alexa568), afin de déterminer le rapport des segments de deux couleurs représenté sur la Fig. 2f. Le suivi de la diffusion des filaments nous a permis de déterminer sans ambiguïté quand deux segments étaient connectés. Les contrôles (sans N-CAP dans le mélange de F-actine) ont été répétés plusieurs fois, et les expériences (avec N-CAP ou mutants) au moins deux fois.

Assais de séparation de l’actine

Pour étudier l’impact de N-CAP sur la séparation par la cofiline, nous avons utilisé deux méthodes différentes, soit (1) en mesurant la fraction de domaines de cofiline uniques qui n’ont pas encore conduit à une séparation, soit (2) en quantifiant le nombre global d’événements de séparation par µm de filament d’actine.

(1) Séparation associée à des domaines de cofiline uniques (figure supplémentaire 3c). Nous avons suivi la procédure décrite précédemment16. Brièvement, à l’intérieur d’une chambre microfluidique, 12 % filaments d’actine marqués Alexa-488 ont été polymérisés à partir de graines de spectrine-actine, ancrées de manière non spécifique à une lamelle couvre-objet passivée par BSA. Les filaments ont été vieillis pendant 15 minutes avec une solution de G-actine à la concentration critique (100 nM G-actine), de sorte que les filaments deviennent >99% ADP46. Les filaments ont ensuite été exposés en continu à 500 nM de mCherry-cofiline-1 seul, avec 2 µM de CAP1 complet ou avec 10 µM de N-CAP. Sur ImageJ, des kymographies des filaments ont ensuite été construites pour suivre la nucléation et l’assemblage des domaines de cofiline uniques et les événements de sectionnement à l’interface avec les segments d’actine nus.

Pour chaque domaine, le temps 0 a été défini au cadre sur lequel ils se sont nucléés. Nous avons ensuite enregistré soit le moment où ils ont induit un événement de séparation, soit le moment où ils sont perdus en raison de la séparation par un autre domaine, de la fusion ou d’un événement de censure. La fraction des domaines qui n’ont pas induit d’événement de sectionnement a ensuite été calculée en utilisant une méthode classique de Kaplan-Meier.

(2) Nombre total d’événements de sectionnement/µm (figure supplémentaire 3d). A l’intérieur des chambres d’écoulement (entre deux lamelles couvre-objet espacées par du ruban adhésif double-face, nous avons d’abord injecté des filaments prépolymérisés marqués Alexa-488 (dans un tampon F, avec 0,2-0,3% de méthylcellulose). La solution a ensuite été échangée avec 500 nM de cofiline-1 non marquée et 0, 1 ou 10 µM de NCAP. Après l’échange, les filaments qui sont restés près de la surface ont été analysés comme suit .

Le nombre d’événements de sectionnement par µm a été calculé comme la fonction cumulative

où Nsev(u) est le nombre d’événements de séparation au temps u, et \(\mathop {\sum}\nolimits_i {l_{i(u)}}\) est la somme sur tous les filaments i de leur longueur au temps u. Comme la solution ne contient pas de G-actine, les filaments se dépolymérisent, et la longueur des filaments diminue donc au cours du temps.

La liaison de N-CAP aux extrémités pointues des filaments

L’expérience a été réalisée dans des chambres à flux (voir test de sectionnement de l’actine (2)), passivées avec de la biotine-PLL-PEG et fonctionnalisées avec de la neutravidine. La F-actine (10% Alexa-568, 1% biotine) a été polymérisée pendant la nuit à 4 µM. Juste avant l’injection dans la chambre, la F-actine a été diluée à 200 nM et mélangée avec 100 nM de N-CAP-GFP, 2 µM de cofiline-1, et 4 nM de protéine de coiffage, dans un tampon F complété par 0,2% de méthylcellulose. Les images des filaments d’actine ont été acquises avant et après une acquisition en continu du canal GFP (5 images/seconde sur 12 s, microscopie TIRF). Pour l’analyse de la liaison aux extrémités des filaments, les filaments d’actine qui n’ont pas bougé pendant l’acquisition en continu ont été sélectionnés en aveugle. La fluorescence a été mesurée sur les deux extrémités de chaque filament, sur une zone de 3 par 3 pixels. Un événement de liaison a été détecté lorsque la fluorescence dépassait un seuil arbitraire (même valeur pour tous les filaments et toutes les extrémités de filament). Comme la protéine de coiffage devrait protéger l’extrémité barbelée, l’extrémité pointue a été attribuée à celle qui présentait le plus d’événements de liaison. La protéine N-CAP-GFP a été détectée dans 17% des points de données à l’extrémité pointue du filament, tandis que l’association non spécifique de la protéine N-CAP-GFP à proximité de l’extrémité barbelée du filament a été détectée dans 1,7% des points de données. La fraction de survie de N-CAP à l’extrémité pointue a ensuite été calculée et ajustée avec une exponentielle unique pour mesurer le taux de déliaison.

Cristallisation et détermination de la structure

Le domaine HFD de la souris a été cristallisé avec 10×His-tag présent, et purifié comme décrit ci-dessus, à l’exception de l’utilisation de 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5 tampon dans la filtration sur gel. L’échantillon a été concentré à 7-10 mg/ml avant la cristallisation et mélangé 1:1 à du cacodylate de sodium 0,1 M, 12% PEG4000 (p/v), pH 6,1 en utilisant une méthode de gouttes assises avec une taille de gouttes de 200 nl dans un format de 96 puits. Après 2 semaines d’incubation, de grands cristaux en forme d’aiguille ont été observés. Pour la collecte de données à distance au Diamond Light Source (UK, Didgot) à la ligne de faisceau I03, les cristaux ont été cryoprotégés par trempage dans un liquide mère contenant 25 % de glycérol et congelés dans de l’azote pour être envoyés à la ligne de faisceau. Les données ont été collectées à 100 K en utilisant une longueur d’onde de 0,9763 Å, un détecteur Pilatus3 6M, une puissance de transmission de 30%, une exposition de 0,05 s et un angle d’oscillation de 0,1° pour un total de 2400 images. Les données de diffraction ont été intégrées et mises à l’échelle avec le logiciel XDS (X-ray Detector Software)54. La solution initiale a été obtenue par remplacement moléculaire en utilisant PHASER55 et PDB = 1s0p comme modèle de recherche. Une solution avec quatre domaines HFD présents dans une unité asymétrique a été trouvée, après quoi de multiples séries de raffinements avec BUSTER56 et la construction manuelle dans COOT57 ont donné un bon ajustement aux données (voir tableau 1). Une amélioration supplémentaire a été obtenue en affinant les données avec l’introduction de paramètres de translation-libération-visage (1/chaîne), la suppression des contraintes non cristallographiques et la modélisation du facteur B atomique individuel. Le Rwork/Rfree final pour le modèle était de 18,6%/23,0% avec une bonne géométrie globale.

Pour la cristallisation du complexe tripartite (de l’ADP-actine, du domaine HFD de la souris CAP1, et du domaine ADF-H C-terminal de la souris twinfilin-1), l’ADP-actine a été préparée en dialyse O/N à +4 °C dans 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM glucose, 0,5 mM β-mercaptoéthanol, pH 8,0. La solution d’actine, contenant 0,3 mM de glucose et 5 U/ml d’hexokinase, a été transférée sur une membrane de dialyse Slide-A-Lyser et mise sur un dispositif de flottaison à +4 °C. Le lendemain, avant la formation du complexe, l’actine a été centrifugée pendant 20 min à 355 040 × g avec le rotor TLA-120. Les protéines ont été mélangées dans un rapport 1:1,1:1,1 (actine, domaine HFD, domaine ADF-H), concentrées à 10-20 mg/ml et utilisées pour la cristallisation comme ci-dessus. Des résultats ont été obtenus à partir de plusieurs conditions différentes, et le cristal le plus diffractant a été obtenu à une concentration de ~10 mg/ml du complexe mélangé 1:1 dans 0.1 M HEPES, 0.1 mM KCl, 10% PEG4000 (w/v), pH 7.0 avec une taille de goutte assise de 200 nl. Le premier jour, plusieurs petits cristaux en forme de diamant sont apparus dans la goutte. Le troisième jour, un grand cristal en forme de tige est apparu alors que tous les petits cristaux étaient dissous. Pour la collecte de données à distance au Diamond Light Source (UK, Didgot) à la ligne de faisceau I03, les cristaux ont été cryoprotégés par trempage dans LV CryoOil (MiTeGen) et congelés dans N2 pour l’expédition. Les données ont été collectées à 100 K en utilisant une longueur d’onde de 0,9762 Å, un détecteur Pilatus3 6M, une puissance de transmission de 20 %, une exposition de 0,05 s et un angle d’oscillation de 0,15° pour un total de 2400 images. Les données de diffraction ont été intégrées et mises à l’échelle avec XDS54. Une solution initiale a été obtenue par remplacement moléculaire en utilisant PHASER55 et PDB = 3daw comme modèle de recherche qui a montré une nette surdensité dans l’extrémité pointue du monomère d’actine. Un autre remplacement moléculaire a donc été effectué, et un modèle initial pour le complexe tripartite a été obtenu en utilisant BALBES58 avec 3daw et 1s0p comme modèles de recherche. Cela a donné une solution avec Q = 0,787 et Rwork/Rfree = 29,7%/35,6%. L’unité asymétrique contenait un complexe unique 1:1:1 de HFD:ADF-H:ADP-actine. De multiples séries de raffinement avec BUSTER56 et de construction manuelle dans COOT57, notamment la reconstruction de la boucle D et des boucles de connexion des α-hélices dans le domaine HFD ont été nécessaires pour améliorer le modèle. Finalement, l’ajout d’eaux, l’introduction de paramètres de traduction-libration-vissage (1/chaîne), et la modélisation du facteur B atomique individuel ont donné un modèle avec un Rwork/Rfree final de 16,6%/19,4% avec une bonne géométrie globale.

Examen des interactions protéine-protéine par filtration sur gel

Pour étudier la liaison des monomères d’actine, l’ADP-G-actine a été préparée comme décrit dans la réf. 34. Toutes les expériences de filtration sur gel ont été réalisées à +4 °C avec une vitesse de fonctionnement de 0,5 ml/min et un fractionnement de 0,5 ml avec une colonne de filtration sur gel Superdex 200 augmentation 10/300 GL équilibrée dans 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4. Cent microlitres de complexe contenant 18 µM de domaine ADF-H de twinfiline, 15 µM d’autres protéines ont été injectés dans la colonne et analysés pour l’élution. Les fractions de pics ont également été analysées par SDS-PAGE. Des expériences de compétition de monomères d’actine ont été réalisées comme ci-dessus, en incluant 15 µM de domaine C-CAP ou CARP aux échantillons. Les fractions de pics ont été analysées par SDS-PAGE, les gels ont été imagés avec le système d’imagerie ChemiDoc XRS + (Bio-Rad), et quantifiés avec Image Lab (Bio-Rad).

Native-PAGE

Les gels mini-Protean TGX 10 % (Bio-Rad) ont été pré-roulés dans un tampon de fonctionnement refroidi (25 mM Tris, 195 mM glycine, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) pendant 1 h avant le chargement. Les échantillons ont été préparés dans un tampon de dialyse ADP-actine (5 mM HEPES ou Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glucose, 0,1 mM DTT, pH 8.0) à une concentration de 20 µM de chaque protéine, mélangés à un rapport 1:1 avec un tampon de chargement 2× (tampon de fonctionnement contenant 20 % de glycérol, du bleu de bromophénol, sans ADP ni MgCl2), puis appliqués à un volume de 5 µl dans des puits d’échantillons de 50 µl. Les gels ont été exécutés à 100 V sur la glace pendant 4 h.

Dosage fluorométrique du désassemblage des filaments d’actine

Le désassemblage à l’état stable des filaments d’ADP-actine a été réalisé comme suit : 5 % de pyrène-actine a été polymérisé dans 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4 pendant 60 min. Les extrémités barbelées des filaments ont été coiffées par 50 nM de protéine de coiffage. Ensuite, 0,5 µM de cofiline (et 0,5 µM de N-CAP) ont été ajoutés, et la réaction a été lancée en ajoutant 4 µM de protéine de liaison à la vitamine D (agent séquestrant des monomères). La concentration finale d’actine était de 2,5 µM. Le désassemblage de l’actine a été mesuré en suivant la fluorescence du pyrène avec excitation à 365 nm et émission à 407 nm sur un spectrophotomètre de fluorescence (Agilent) pendant 2400 s à 22 °C.

Spectrométrie CD

Les spectres CD pour le type sauvage N-CAP, les mutants et le domaine HFD ont été mesurés à 20 °C avec le spectropolarimètre J-720 (Jasco), dans une cuvette en quartz de 300 µl de 0,1 cm de trajet lumineux avec les paramètres suivants : mode de balayage continu avec une vitesse de balayage de 50 nm/min, largeur de bande de 0,5 nm, gamme d’ondes de 190 à 260 nm, pas de données de 0,5 nm. Toutes les protéines ont été diluées à 15 µM avec un tampon PBS à 10%. L’accumulation de dix scans pour chaque protéine a été tracée comme une seule courbe.

Modèles pour les simulations MD atomistiques

Les modèles d’actine décorée par la cofiline ont été basés sur la structure de microscopie cryo-électronique de résolution 3,8 Å (PDBID : 5YU8)41. Les boucles manquantes ont été construites en utilisant RosettaCM59 et RosettaScripts60 en présence de la carte de densité électronique41 imposant la symétrie hélicoïdale associée. Pour correspondre aux constructions expérimentales de ce travail, les séquences d’actine et de cofiline ont été, à ce stade, changées de celles du poulet à celles du lapin et de la souris, respectivement. Plus de 1000 modèles ont été générés. Ils ont ensuite été triés en fonction de leur score total et ceux qui contenaient des artefacts structurels (par exemple, des liaisons peptidiques cis) ont été éliminés par filtrage. Des simulations de dynamique moléculaire (MD) ont été lancées à partir des trois modèles ayant obtenu le meilleur score (tableau supplémentaire 1, simulations F1-3).

Le complexe HFD-actine a été isolé du complexe cristallisé domaine HFD/actine/twinfiline domaine ADF-H et arrimé séparément sur les modèles de filaments d’actine décorés de cofiline sélectionnés décrits ci-dessus. À cette fin, l’actine HFD isolée a été superposée à chaque monomère d’actine à extrémité pointue, qui a ensuite été remplacé par l’actine HFD. De cette façon, la conformation de la structure cristalline du dimère actine-HFD est transférée à l’extrémité de l’actine décorée de cofiline. Les modèles ancrés ont d’abord été raffinés localement à l’aide du protocole d’ancrage61, suivi d’une relaxation restreinte avec le protocole fast relax62 distribué avec la suite logicielle Rosetta. Ce processus a été appliqué séparément pour chaque filament d’actine décoré de cofiline sélectionné pour les simulations MD (tableau supplémentaire 1, simulations C1-3).

Construction du segment d’extrémité pointu pour les simulations MD

Chaque simulation a été réalisée sur un segment d’extrémité pointu du modèle de filament d’actine décoré de cofiline sélectionné, qui a été créé en tranchant le modèle perpendiculairement à l’axe du filament. Le plan du découpage a été choisi de manière à ce que quatre monomères d’actine liés à l’ADP-Mg2+ et trois monomères de cofiline entiers soient inclus dans le segment (Tableau supplémentaire 1, simulations F1-3). Le segment contenait également les deux domaines HFD à l’extrémité pointue dans les systèmes liés au HFD (tableau supplémentaire 1, simulations C1-3). Le segment à extrémité pointue contenait également plusieurs fragments polypeptidiques de cofilines et d’actines à son extrémité barbelée (figure supplémentaire 5a). Pour maintenir leur conformation et leur position pendant les simulations, ces chaînes brisées ont été maintenues en position tout au long des simulations comme suit : Une couche de résidus à l’interface avec le reste du segment terminal pointu a été laissée libre ; tous les atomes lourds près du plan de coupe et seulement les atomes lourds du squelette pour les régions intermédiaires ont été retenus avec une constante de force de 100 kJ/mol/nm2 (figure supplémentaire 5a). Ces fragments polypeptidiques partiellement retenus à l’extrémité barbelée agissent comme une plateforme pendant les simulations. Cette approche maintient à la fois l’interface protéine-protéine de type filament à l’extrémité barbelée et l’orientation du filament pendant les simulations.

Les états de protonation des résidus ont été déterminés au pH neutre sur la base des calculs de pKa en utilisant PROPKA363. Chaque résidu H73 de l’actine a été méthylé (Nτ-Méthyl-l-histidine, HIC), et les terminaisons N de l’actine, de la cofiline et du HFD ont été acétylées. Les topologies de chaque molécule des systèmes ont été préparées avec le programme LeAP distribué avec ambertools1864, qui ont ensuite été converties au format GROMACS en utilisant l’outil ParmEd.

Chaque tranche d’extrémité pointue créée à partir des modèles sélectionnés a été placée dans une boîte de simulation de prisme hexagonal avec son axe long aligné avec l’axe z. Les dimensions de la boîte ont été choisies pour avoir une distance minimale d’environ 17 Å entre le filament et chaque face de la boîte (tableau supplémentaire 1). Chaque système a été solvaté avec une solution de NaCl 0,15 M, le nombre d’ions étant ajusté pour neutraliser le système.

Avant les cycles de production, une minimisation par descente la plus raide et de courtes simulations d’équilibrage successives (au total ~7 ns) dans les ensembles NVT et NpT en utilisant le thermostat de Berendsen et le barostat65 ont été réalisées. Des contraintes positionnelles harmoniques ont été appliquées à la tranche d’extrémité pointue pendant ces simulations d’équilibrage. Un plus petit groupe d’atomes (tous les atomes lourds, le squelette de la protéine, et finalement seulement les atomes Cα) ont été retenus dans chaque simulation d’équilibrage consécutive avec une constante de force de 1000 kJ/mol/nm2.

Les systèmes qui ont été ramifiés à partir des autres (tableau supplémentaire 1 ; C1′, C2′. F2′) ont été préparés en effectuant la modification appropriée (amarrage ou retrait des domaines HFD), en retirant les molécules de solvant qui se chevauchaient (lorsque les domaines HFD étaient amarrés), et en réajustant la taille de la boîte et les atomes de solvant pour la nouvelle taille du système. L’équilibrage NVT et NpT étagé avec des contraintes a été effectué comme mentionné ci-dessus (au total ~200 ps pour les simulations où les domaines HFD ont été retirés, et au total ~4 ns lorsqu’il est docké).

Toutes les séries de production ont été effectuées pendant 1-2.5 μs dans l’ensemble NpT avec seulement les contraintes positionnelles susmentionnées sur la région de la plate-forme.

Champs de force et paramètres dans les simulations MD

Les champs de force et les ensembles de paramètres suivants ont été employés dans les simulations MD : Amber ff14sb66 pour les protéines, le modèle TIP3P67 pour l’eau, le jeu de paramètres d’ions monovalents de Joung et Cheatham68 pour Na+ et Cl-, un modèle d’ions multisites octaédriques de Saxena et Sept69 pour Mg2+, et un jeu de paramètres de composés polyphosphorylés de Meagher et al.70 pour l’ADP. Les paramètres de liaison manquants pour la méthyl-histidine (Nτ-Méthyl-l-histidine, HIC) ont été adoptés à partir du champ de force GAFF264. Les charges atomiques ont été calculées selon le protocole de Duan et al.71 Le logiciel R.E.D.III.572 a été utilisé pour l’ajustement du potentiel électrostatique contraint (RESP) multi-conformation en utilisant une conformation étendue et une conformation α-hélicoïdale du dipeptide HIC (Ace-HIC-Nme). Tous les calculs de chimie quantique ont été effectués en utilisant la suite de programmes Gaussian0973 au niveau de théorie b3LYP/cc-pVTZ. Les calculs de charge ont été effectués avec le modèle IEFPCM dans un continuum polarisable avec une constante diélectrique de 4 en fixant le solvant comme éther.

Protocoles de simulation MD

Toutes les simulations ont été effectuées en utilisant GROMACS 2018 74. Les équations du mouvement ont été intégrées en utilisant un algorithme de saute-mouton avec un pas de temps de 2 fs. Toutes les liaisons ont été contraintes à l’aide de l’algorithme LINCS75. Les protocoles de simulation ont été choisis en fonction de la réf. 66. Les interactions électrostatiques à longue portée ont été traitées par le schéma Ewald à maillage de particules lisses76 avec une coupure de l’espace réel de 0,8 nm, un espacement de Fourier de 0,12 nm et une interpolation de quatrième ordre. Le potentiel de Lennard-Jones avec une coupure de 0,8 nm a été utilisé pour les interactions de van der Waals. Des corrections de dispersion à longue portée ont été appliquées pour l’énergie et la pression77.

Toutes les simulations de production ont été réalisées dans l’ensemble NpT. La tranche d’extrémité pointue, la plate-forme et le solvant (eau et NaCl 0,15 M) ont été couplés à des bains de température séparés à 310 °K en utilisant le thermostat de Nosé-Hoover78,79 avec une constante de temps de 1,0 ps. Le couplage de pression isotrope a été effectué à l’aide du barostat de Parrinello-Rahman80 avec une pression de référence de 1 atm, une constante de temps de 5 ps et une compressibilité de 4,5 × 10-5 bar-1.

Analyse des simulations MD

Toutes les analyses ont été effectuées à l’aide de VMD81 et de scripts maison. Les calculs MMGBSA ont été effectués à l’aide du logiciel MMPBSA.py82 distribué avec ambertools1864 en employant le modèle GB modifié développé par Onufriev et al.83 avec une concentration de sel de 0,15 M (trames échantillonnées toutes les 100 ns en écartant les 500 premières ns de chaque simulation).

Analyses structurelles

Pour l’analyse des différentes structures d’actine et de leurs états conformationnels présentés dans la figure 1d, nous avons suivi le protocole de Tanaka et al41,84. en utilisant la structure F-actine (PDB 6djo) comme référence.

Analyse statistique et reproductibilité

Les données des Figs. 2d, 4b et 4d ont été regroupées à partir de plusieurs expériences réalisées à des jours différents, représentant ainsi les données de plusieurs expériences indépendantes. Les panneaux 2f, 2g, 2h et 3d présentent des données analysées à partir d’une seule expérience représentative. n décrit le nombre de filaments analysés pour les panneaux 2d, 2f, 2g, 4b et 4d. n dans le panneau 6c correspond au nombre de fois que l’expérience a été réalisée.

Les expériences dans les figures supplémentaires 2a-d, 3c, 6a-d ont été réalisées avec des résultats similaires au moins deux fois. Les expériences en 3d, l’expérience de compétition du domaine CARP en 6a, et les expériences dans des conditions favorisant l’assemblage en Fig. 7 ont été réalisées une fois.

Résumé du rapport

Des informations supplémentaires sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé du rapport de Nature Research lié à cet article.