Les souches de Streptococcus pyogenes provenant. Infections invasives sévères se lient aux cellules HEp2 et HaCaT plus avidement que les souches provenant d’infections non compliquées

Streptococcus pyogenes (streptocoque du groupe A ) est un agent étiologique de diverses maladies humaines, notamment la pharyngite, la pyodermie et les maladies invasives graves. En outre, cet agent pathogène est associé à des séquelles potentiellement mortelles telles que la glomérulonéphrite poststreptococcique et le rhumatisme articulaire aigu. Dans le Territoire du Nord (NT) de l’Australie, l’incidence du rhumatisme articulaire aigu est très élevée parmi la population indigène (3), malgré un faible taux d’isolement du SGA dans la gorge. En outre, la pyodermite due à l’infection par le SGA est extrêmement courante et la glomérulonéphrite poststreptococcique est endémique dans de nombreuses communautés aborigènes isolées (4, 7). Alors que le portage asymptomatique de la gorge est souvent le réservoir déclaré des souches associées aux maladies invasives (5), dans les populations où l’impétigo est endémique, comme dans les communautés autochtones des Territoires du Nord-Ouest, le principal réservoir est la peau. Indépendamment du tissu qui est le site primaire de l’infection, le premier événement que l’agent pathogène doit réaliser est l’adhésion aux cellules de l’hôte. Le génome de S. pyogenes code pour de nombreux gènes qui pourraient être considérés comme codant pour des adhésines. Ces gènes sont hautement régulés et les souches individuelles n’ont pas le potentiel génétique de coder toutes ces protéines. Les adhésines comprennent la protéine M (une molécule antiphagocytaire), la capsule et les protéines de liaison à la fibronectine. Il existe de nombreuses protéines de liaison à la fibronectine, telles que SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2) et SfbII (11). La capacité d’adhérence d’une souche individuelle pourrait varier en fonction du répertoire de gènes pour les adhésines que la souche possède et de leur niveau d’expression. Ceci peut à son tour refléter les différences dans la capacité à coloniser et à infecter de manière persistante différents sites tissulaires. Un corollaire de cela est que les isolats de différents sites tissulaires peuvent présenter des différences dans la capacité d’adhérence. Pour tester cela, nous avons déterminé l’étendue de la liaison des isolats de GAS provenant de la peau, de la gorge et du sang aux lignées cellulaires HEp2 et HaCaT, représentant respectivement les cellules épithéliales du larynx humain et les kératinocytes.

Les isolats de GAS provenant des TN ont été collectés entre 1990 et 2002. Les 72 souches analysées dans cette étude ont été isolées du sang (n = 26), de la peau (n = 22) et de la gorge (n = 24) (tableau 1). Les isolats sanguins provenaient de maladies graves, et les autres souches provenaient d’infections non compliquées. Les isolats ont été soumis à un typage viral comme décrit précédemment (6). Le typage Vir fait appel au polymorphisme de longueur des fragments de restriction du régulon mga, qui comprend le gène de la protéine M hautement variable. Afin d’assurer l’inclusion de souches non liées épidémiologiquement, un isolat représentatif de chaque type Vir a été inclus. Les cultures ont été cultivées pendant la nuit à 37°C dans un agitateur orbital jusqu’à la phase stationnaire dans du bouillon Todd-Hewitt (Oxoid, Basingstoke, Royaume-Uni) complété par 1% d’extrait de levure. Pour préparer l’inoculum de streptocoques du groupe A pour les essais d’adhérence, les cultures d’une nuit ont été centrifugées, les culots ont été lavés dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) et resuspendus dans un milieu RPMI 1640 sans sérum et sans antibiotique (Life Technologies) jusqu’à une densité optique à 600 nm de 0,05. Cela représente environ 1 × 107 à 1,5 × 107 bactéries par ml.

Les cellules épithéliales laryngées humaines (HEp2) ont été maintenues dans un milieu RPMI 1640 complété par 10 % de sérum de veau fœtal (Life Technologies), 1 % de Fungizone (Life Technologies), 20 μg de vancomycine HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Australie) par ml et 100 μg de sulfate de streptomycine (Sigma, St. Louis, Mo) par ml. Les kératinocytes humains adultes de la peau (cellules HaCaT) ont été maintenus dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (Life Technologies) complété par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur. Pour les tests d’adhérence, ∼105 cellules/ml ont été ensemencées sur des lamelles de verre de 12 mm de diamètre dans le fond de plaques de culture tissulaire à 24 puits (Nunc, Roskilde, Danemark). Après une croissance d’une nuit à 37°C dans une atmosphère de CO2 à 5%, les cellules ont été lavées avec du PBS (pH 7,4) et inoculées avec 500 μl de l’inoculum de GAS. Après 2 h d’incubation à 37°C, les lamelles ont été lavées cinq fois en ajoutant 1 ml de PBS dans chaque puits, et après un mélange doux, la solution de lavage a été éliminée par aspiration. Après élimination des bactéries non adhérentes, les cellules hôtes et les bactéries adhérentes ont été fixées avec du méthanol à 95 % et séchées à l’air. Après fixation à la chaleur, les lamelles ont été placées sur des lames et colorées au Gram pour être observées en immersion dans l’huile. Dans chaque expérience, les cellules de plusieurs champs aléatoires ont été analysées, et l’attachement a été exprimé comme le nombre moyen de chaînes GAS par cellule. Tous les essais ont été réalisés en double, et la fixation moyenne a été déterminée pour chaque souche. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le programme Stata Statistics/Data Analysis version 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). Les données ont été analysées avec des tests t.

Les souches de GAS ont adhéré aux deux types de cellules, et le degré de liaison variait d’une souche à l’autre (tableau 1). Il y avait une bonne corrélation entre les expériences indépendantes avec 20 isolats répétées à deux intervalles de temps (données non présentées), ce qui suggère que l’avidité de la liaison est reproductible et spécifique à la souche. Dans l’ensemble, la liaison du GAS aux cellules HaCaT est plus importante qu’aux cellules HEp2 (P < 0,05). Lorsque les données du tableau 1 ont été séparées en fonction du site tissulaire d’isolement, une moyenne de 270 chaînes de souches de streptocoques du groupe sanguin se sont liées à 50 cellules HaCaT (Fig. 1). En revanche, les isolats de la peau et de la gorge n’ont lié en moyenne que 169 et 178 chaînes par 50 cellules HaCaT, respectivement. Ces différences sont statistiquement significatives (P = 0,0044 et 0,0063, respectivement). Il est intéressant de noter que pour les cellules HEp2, les différences sont moins prononcées et ne sont pas statistiquement significatives. Cependant, lorsque les données ont été réanalysées sur la base des infections invasives par rapport aux infections non compliquées en combinant les données pour les isolats de la peau et de la gorge, des différences significatives entre les deux catégories ont été trouvées dans les deux lignées cellulaires (P = 0,0011 pour HaCaT ; P = 0,0238 pour HEp2).

Des travaux antérieurs de ce laboratoire ont montré que de nombreuses souches de S. pyogenes circulant couramment pouvaient provoquer une maladie invasive avec la peau comme principal site d’infection (1). Ces observations sont cohérentes avec les résultats actuels d’une avidité plus élevée des souches de SGA NT pour les lignées cellulaires HaCaT que HEp2 et les isolats sanguins étant capables de se lier en plus grand nombre que les isolats provenant d’infections non compliquées. Les explications possibles de la forte propension à l’adhésion des isolats sanguins de S. pyogenes comprennent les différences génotypiques et phénotypiques entre les isolats provenant de sources de maladies invasives et non invasives. D’autres études sont nécessaires pour définir la nature de cette avidité de liaison et pour déterminer si elle est constante au sein des populations clonales.