La réduction in vivo de RyR1 dans le muscle déclenche une myopathie de type noyau

Génération du modèle de souris RyR1Flox/Flox: :HSA-Cre-ERT2

Une lignée de souris avec des sites loxP insérés de part et d’autre des exons 9-11 du gène RYR1 (appelée RyR1Flox/Flox) a été accouplée avec la lignée de souris HSA-Cre-ERT2 exprimant la recombinase Cre-ERT2 dépendante du tamoxifène sous le contrôle du gène α-actine du muscle squelettique humain , pour créer RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2. L’injection de tamoxifène induit l’activation de la recombinase Cre-ERT2 sélectivement dans le muscle squelettique, ce qui entraîne la délétion des exons 9-11 et la perturbation du gène RYR1 dans le muscle squelettique avec une stricte dépendance au tamoxifène (Fig. 1a). À la naissance, les souris RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 étaient normales, et à l’âge de 2 mois, une fois de jeunes adultes, la recombinaison a été induite par injection de tamoxifène (à partir de ce moment, les animaux recombinés ont été appelés RyR1-Rec). Les conséquences moléculaires et physiologiques ont ensuite été étudiées en fonction du temps, jusqu’à 105 jours après l’induction de la recombinaison (Fig. 1b). Les animaux témoins (CTRL) sont des compagnons de portée RyR1Flox/Flox (sans le transgène HSA-Cre-ERT2) injectés avec du tamoxifène. Le phénotype global des souris recombinées à 75 jours est caractérisé par une cyphose associée à une mobilité anormale des membres postérieurs et une marche dandinante. Les animaux sont encore capables de se tenir sur leurs pattes arrière pour se nourrir, mais des granulés de nourriture ont été systématiquement donnés directement dans la cage au fur et à mesure de la progression de la maladie. A 105 jours, les animaux sont toujours mobiles dans leur cage et aucune augmentation du taux de mortalité n’a été observée par rapport au CTRL. Les mâles et les femelles ont été affectés. La quantité relative de RyR1 au niveau de l’ARNm a été analysée dans le muscle quadriceps tous les 15 jours après la recombinaison en utilisant la RT-q-PCR chez les animaux CTRL et chez les animaux RyR1-Rec (Fig. 1c). Une chute rapide de l’ARNm RyR1 a été observée, avec un niveau faible et stable de 21% ± 4% de la valeur initiale atteint dès 3 jours après l’injection de tamoxifène. Une réduction a été observée dans tous les muscles testés 75 jours après l’induction de la recombinaison (Quadriceps, tibialis anterior, EDL, soleus, fichier additionnel 1 : Fig. S1A). La quantité de protéine RyR1 a été analysée plus en détail, en utilisant le Western blot quantitatif dans les homogénats de muscle quadriceps (Fig. 1d, e). Cette quantité a été progressivement réduite et a atteint environ 50 % de la valeur initiale après 105 jours. Aucune autre réduction de la protéine RyR1 n’a été observée sur des durées plus longues (données non présentées). La quantité de protéine RyR1 a été quantifiée dans différents homogénats musculaires 75 jours après la recombinaison. Une réduction a été observée dans tous les muscles testés, bien que la quantité restante diffère légèrement entre les muscles, la plus élevée étant dans l’interosseux (64% ± 5%) et la plus faible dans le soléaire (33% ± 5%) (fichier supplémentaire 1 : Fig. S1B).

Les souris RyR1-Rec présentent une réduction progressive du poids des muscles et du corps ainsi que de la force musculaire

Les conséquences de la réduction de RyR1 ont d’abord été étudiées au niveau de l’animal entier. Initialement au même poids, les animaux CTRL ont lentement pris du poids, passant de 24,4 ± 0,4 à 30,6 ± 0,8 g à J90, tandis que les animaux RyR1-Rec ont progressivement perdu du poids pour atteindre 20,6 ± 1,3 g à J90 (Fig. 2a). Les mâles et les femelles ont été affectés et ont perdu environ 13% de leur poids corporel initial après 75 jours (Fichier additionnel 1 : Fig. S1C). Ceci est le résultat d’une perte de poids observée dans tous les muscles (Additional file 1 : Fig. S1D). Pour tester la performance musculaire globale après la réduction de RyR1, les animaux ont été soumis à deux tests de force différents. Ils ont d’abord été autorisés à se suspendre en saisissant une surface croisée avec les quatre pattes jusqu’à 5 min, la latence de chute reflétant la force musculaire. Le test de préhension effectué chaque semaine pendant 105 jours (Fig. 2b) a montré que les animaux RyR1-Rec ont commencé à perdre de la force 20-30 jours après l’injection de tamoxifène, lorsque la quantité de RyR1 était d’environ 75-80% de sa valeur initiale, et qu’ils étaient incapables de se suspendre à la grille environ 75 jours après l’injection de tamoxifène, la quantité de RyR1 ayant atteint le niveau d’environ 60%. La force musculaire a également été évaluée par un protocole d’électrostimulation non invasif de 6 minutes du muscle gastrocnémien couplé à une imagerie par résonance magnétique (IRM) anatomique sous anesthésie générale. Au cours du protocole d’électrostimulation des animaux CTRL 30 jours après l’injection de tamoxifène (Fig. 2c, J30), un profil d’exercice typique a été enregistré, avec une force musculaire initiale stable qui a lentement décliné au fur et à mesure de la fatigue musculaire. Dans le groupe CTRL à J60 et J90, le profil d’exercice a montré une amélioration de la force musculaire lorsque les animaux ont vieilli (Fig. 2c). En revanche, les performances des animaux RyR1-Rec, similaires à celles du groupe CTRL à J30, se sont détériorées avec l’âge. Les animaux RyR1-Rec n’étaient plus capables de réaliser l’exercice à J90 (Fig. 2c, RyR1-Rec D90). Le volume du gastrocnémien mesuré à l’aide d’images RM (Fig. 2d) est resté stable chez les animaux CTRL de J30 (161 ± 5 mm3) à J90 (164 ± 4 mm3). En revanche, chez les souris RyR1-Rec, le volume du gastrocnémien était significativement plus faible que chez les souris CTRL depuis J30 (141 ± 3 mm3, p = 0,003), et était encore réduit jusqu’à 100 ± 3 mm3 à J60 (p < 0,001 par rapport aux CTRL au même âge) et 69 ± 4 mm3 à J90 (p < 0,001 par rapport aux CTRL au même âge). La tension spécifique maximale du twitch (tension absolue du twitch normalisée par rapport au volume musculaire) confirme que les deux groupes présentaient une force musculaire similaire à J30 (Fig. 2e), mais la force des animaux RyR1-Rec a considérablement diminué alors qu’elle a augmenté chez les animaux CTRL à mesure qu’ils vieillissaient. De plus, les changements bioénergétiques du muscle gastrocnémien pendant l’électrostimulation ont été évalués de manière non invasive à J60 en utilisant la spectroscopie MR 31-phosphore (31P) in vivo. Alors que le pH intramyofibrillaire basal ne différait pas entre les deux groupes (fichier complémentaire 1 : Fig. S2A), l’étendue de l’acidose à la fin de l’exercice était plus faible (p = 0,016) chez les animaux RyR1 Rec (fichier complémentaire 1 : Fig. S2B), ce qui suggère que le flux glycolytique dans le muscle en exercice était réduit chez ces animaux. De plus, la constante de temps de la resynthèse de phosphocréatine post-exercice (τPCr) était significativement plus courte (p = 0,047) chez les souris RyR1-Rec (Additional file 1 : Fig. S2C, D), reflétant une meilleure fonction mitochondriale in vivo. En effet, la synthèse de PCr pendant la période de récupération post-exercice repose exclusivement sur la synthèse oxydative de l’ATP, et τPCr est donc considéré comme un indice de la capacité de phosphorylation oxydative. Globalement, ces résultats indiquent que la réduction progressive de RyR1 est associée à une perte progressive de poids et à une baisse de la force musculaire.

Les propriétés physiologiques des fibres isolées sont compromises chez les souris RyR1-Rec

L’altération de la fonction musculaire a été davantage caractérisée au niveau de la fibre musculaire unique en utilisant une combinaison de voltage-clamp à cellule entière et d’imagerie confocale . Le réseau de tubules T a été imagé en colorant la membrane plasmique avec du di-8-anepps. Aucune différence qualitative dans le réseau (Fig. 3a, à gauche) ou quantitative dans la densité moyenne des T-tubules entre les fibres CTRL et RyR1-Rec n’a été observée, à côté d’un raccourcissement léger mais significatif de la longueur moyenne des sarcomères au repos (Fig. 3a, graphiques à droite). L’influx de Ca2+ activé par le voltage à travers le DHPR (Fig. 3b-d) et le flux de libération de Ca2+ à travers RyR1 (Fig. 3e-i) ont été évalués simultanément. Comparées aux fibres CTRL, les fibres RyR1-Rec présentaient des courants Ca2+ DHPR activés par la tension d’une durée similaire (Fig. 3b) mais d’une densité réduite, comme le montre la densité de courant maximale en fonction de la tension dans les deux groupes (Fig. 3c), ce qui s’est traduit par une réduction de 30 % de la conductance maximale (Gmax) sans changement associé des autres paramètres de la relation courant/tension (Fig. 3d). La dépendance au voltage de la libération de Ca2+ dans le RS a été évaluée à partir de l’imagerie linéaire du colorant sensible au Ca2+, le rhod-2. Les images linéaires des fibres RyR1-Rec étaient qualitativement similaires à celles des fibres CTRL (Fig. 3e), montrant une augmentation rapide de la fluorescence lors de la dépolarisation de la membrane du tubule T, spatialement homogène le long de la ligne balayée. La vitesse de libération du Ca2+ dans le SR (Fig. 3g), calculée à partir des changements de la fluorescence du rhod-2 provoqués par des impulsions dépolarisantes d’amplitude croissante (Fig. 3f), a présenté une évolution temporelle similaire dans la fibre RyR1-Rec et dans les fibres CTRL, mais, fait important, les valeurs maximales étaient réduites dans la fibre RyR1-Rec. L’ajustement du taux maximal de libération de Ca2+ en fonction de la tension (Fig. 3h-graphe du haut) a indiqué que le taux maximal de libération de Ca2+ était réduit de 25 % dans le groupe RyR1-Rec (Fig. 3i, Max), le facteur de pente (k) était également légèrement mais significativement réduit, alors que la tension de mi-activation (V0,5) était inchangée. Une augmentation légère (1,3 ms en moyenne) mais significative du temps par rapport au pic de la libération de Ca2+ dans les fibres RyR1-Rec (Fig. 3h, graphique du bas) a été observée. Aucune modification n’a été observée dans les capacités d’élimination du Ca2+ cytosolique des fibres (fonction de pompe SERCA), mesurée avec le colorant fluo-4 FF sensible au Ca2+ de faible affinité dans des conditions sans tamponnage par l’EGTA (fichier supplémentaire 1 : Fig. S3). Globalement, ces résultats démontrent que la réduction de 35 % de la quantité de RyR1 dans les interosseux est associée à une réduction de 30 % du courant calcique à travers le DHPR et à une réduction de 25 % du flux calcique à travers RyR1.

La réduction de RyR1 affecte la structure du muscle squelettique

Pour mieux comprendre les bases de ces altérations fonctionnelles associées à une diminution de RyR1, la structure musculaire a été étudiée sur des animaux RyR1-Rec à J75 après recombinaison, et comparée à des animaux CTRL. L’Extensor digitorum longus (EDL), un muscle à contraction rapide, le soleus, un muscle à contraction lente et le tibialis anterior (TA), un muscle mixte, ont été analysés à l’aide de colorations à l’hématoxyline-éosine, au NADH et au trichrome de Gomori. Les colorations du TA, présentées sur la Fig. 4a, montrent une structure musculaire anormale chez les animaux RyR1-Rec, sans fibrose ni noyau central, mais avec une atrophie des fibres, affectant à la fois les fibres de type I et de type II (Tableau 2). Une désorganisation des mitochondries caractérisée par une accumulation/déplétion locale dans les régions adjacentes d’une même fibre (tête de flèche et encart Fig. 4a) et une accumulation de la coloration rouge observée avec le trichrome de Gomori (fichier additionnel 1 : Fig. S4) a également été observée, ressemblant aux noyaux poussiéreux récemment décrits chez les patients . Une atrophie des fibres a été observée dans les deux types de fibres dans l’EDL, bien que la réduction ait été légèrement plus importante dans les fibres de type I (tableau 2). Des sections transversales TA de souris CTRL et RyR1-Rec ont été colorées avec des anticorps contre RyR1 et desmine. Aucune modification n’a été observée dans la distribution de RyR1 entre les fibres de type I et de type II dans les sections TA RyR1-Rec, indiquant une réduction similaire de RyR1 dans tous les types de fibres (Fig. 4b). De manière surprenante, une modification importante a été observée dans la distribution de la desmine, avec une augmentation considérable dans les petites fibres de type I (Fig. 4b) : dans les sections TA CTRL, toutes les fibres présentaient une coloration périphérique similaire, alors que les petites fibres de type I dans les sections TA RyR1-Rec étaient fortement colorées à la fois à la périphérie des fibres et dans le cytosol (encart Fig. 4b). Bien que le marquage IF ne soit pas quantitatif, ces résultats montrent que la réduction de RyR1 était très probablement homogène, sans différence énorme entre les fibres adjacentes comme cela a été observé pour la desmine, la quantification réalisée par Western blot étant le reflet de la protéine contenue dans chaque fibre et non une moyenne des fibres avec 0% de RyR1 et des fibres avec 100% de RyR1 dans le même muscle.

L’organisation des triades a été étudiée plus en détail en utilisant un marquage immunofluorescent des fibres isolées du LDE (Fig. 5a). Le marquage de l’alpha-actinine (en tant que marqueur de la ligne Z), de la triadine et de RyR1 (en tant que marqueurs de triades) sur la fibre EDL RyR1-Rec a démontré que la réduction de la quantité de RyR1 a entraîné une désorganisation généralisée de la fibre avec une localisation anormale des triades et une perturbation de la ligne Z, mais la triadine et RyR1 étaient encore partiellement colocalisés. Bien que les triades soient restées des deux côtés de la ligne Z, celle-ci ne formait pas une ligne droite comme dans le cas du CTRL et présentait au contraire de nombreuses microdisruptions (encadré Fig. 5a). L’ultrastructure musculaire a été analysée par microscopie électronique sur les fibres RyR1-Rec EDL à J75 (Fig. 5b). Certaines régions présentaient une structure relativement préservée (Fig. 5b, fibre de gauche), tandis que certaines régions adjacentes étaient fortement désorganisées, avec une perturbation de l’organisation régulière des sarcomères, une désorganisation des mitochondries et la présence de nombreux empilements de membranes (Fig. 5b, flèches, agrandies dans l’encadré), précédemment appelés triades multiples . Les caractéristiques morphologiques de ces triades multiples comparées aux triades simples normales sont présentées dans le tableau 3, et des exemples supplémentaires sont présentés dans le fichier supplémentaire 1 : Fig. S5. La quantification précise de la largeur putative des T-tubules, de la largeur putative des SR et de l’espace intermembranaire (T-tubules/SR) (Additional file 1 : Fig. S5) a démontré une augmentation considérable de la taille moyenne des T-tubules dans ces triades multiples (augmentation de deux fois, atteignant 202% de la taille des T-tubules dans la triade normale), alors que la largeur moyenne des SR n’était que légèrement augmentée (+ 10%) et que l’espace intermembranaire n’était pas modifié. Ces résultats indiquent une désorganisation structurelle généralisée des muscles des souris RyR1-Rec associée à un remodelage des membranes.

La réduction de RyR1 est associée à une modification de la quantité de nombreuses protéines

Les conséquences de la réduction de RyR1 ont été étudiées au niveau moléculaire en utilisant le Western blot quantitatif sur le muscle quadriceps de souris CTRL ou RyR1-.Rec (8 animaux dans chaque groupe) à J75 après injection de tamoxifène (Fig. 6). La quantité relative de nombreuses protéines impliquées directement ou indirectement dans la gestion du calcium a été estimée, en utilisant comme référence la quantité totale de protéines déterminée par évaluation sans coloration . Aucune différence dans la quantification de RyR1 n’a été observée entre cette méthode et l’utilisation de la chaîne lourde de myosine comme protéine de référence (comparaison entre les Figs. 1, 6). Aucune modification significative entre les muscles CRTL et RyR1-Rec n’a été observée dans la quantité de l’isoforme T95 de la triadine, de la protéine de liaison au calcium CSQ1, de la Ca2+-ATPase SERCA, de la FoF1-ATPase mitochondriale et de la sous-unité alpha 1 de la DHPR (Fig. 6a, b). En revanche, on a observé une augmentation de la quantité de STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), de l’isoforme de triadine T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), de CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004) et d’ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017). La modification de la localisation de la protéine structurelle desmine ayant été observée par marquage immunofluorescent (Fig. 5b), le niveau d’expression de la desmine a également été quantifié et une augmentation considérable de la quantité de desmine a été observée (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). La localisation de CLIMP63 et STIM1 dans les fibres de la LDE RyR1-Rec a été analysée par marquage immunofluorescent, et aucune modification majeure n’a été observée (fichier supplémentaire 1 : Fig. S6). Par conséquent, la réduction de la protéine RyR1 a été associée à une augmentation de différentes protéines impliquées dans la régulation du calcium ou dans l’architecture musculaire.

L’autophagie est altérée suite à la réduction de RyR1

Une altération de l’autophagie a été observée dans certaines myopathies . Afin d’identifier les mécanismes conduisant à l’atrophie musculaire consécutive à la réduction de RyR1, nous avons recherché des modifications du flux d’autophagie dans les muscles RyR1-Rec. La quantité de LC3 II, une protéine membranaire des autophagosomes, a été évaluée par Western blot quantitatif (Fig. 7a, b), et une augmentation de LC3 II a été observée (172% ± 32%, p = 0,03). Cette augmentation des autophagosomes pourrait refléter soit une augmentation de la formation d’autophagosomes (due à une augmentation du processus d’autophagie), soit une diminution de leur fusion avec les lysosomes (et donc une inhibition de la dégradation par autophagie). La nature précise de la modification du flux d’autophagie a été analysée plus avant par la quantification de p62, une protéine bien connue spécifiquement dégradée par l’autophagie, dont la quantité était également significativement augmentée (Fig. 7a, b, 172% ± 22%, p = 0,006). L’augmentation associée de LC3 II et de p62 dans le muscle RyR1-Rec par rapport au contrôle suggère que la réduction de RyR1 est donc associée à une inhibition du flux d’autophagie. De plus, une augmentation de l’activation (phosphorylation) de deux inhibiteurs de l’autophagie, mTOR et la protéine S6 (Fig. 7b, c), a été observée (augmentation de P-mTOR/mTOR de 174% ± 17%, p = 0,01 ; augmentation de P-S6/S6 de 320% ± 50%, p < 0,001). L’augmentation de la phosphorylation de ces deux inhibiteurs de l’autophagie chez les animaux RyR1-Rec par rapport aux témoins pointait davantage vers une inhibition de l’autophagie responsable de l’atrophie musculaire chez les animaux RyR1-Rec.

Les biopsies de patients humains présentent des défauts similaires à ceux observés chez les souris RyR1-Rec

Dans une étude récente sur une large cohorte de patients atteints d’une myopathie congénitale récessive , nous avons identifié la présence de structures atypiques, appelées « noyaux poussiéreux », chez plus de la moitié des patients présentant une réduction de la quantité de RyR1. Ces structures ont été observées par des colorations multiples et diffèrent du noyau central classique (régions bien définies dépourvues de colorations oxydatives) par leurs limites mal définies, leur désorganisation myofibrillaire focale, un dépôt de matériel granulaire rouge-violet à la coloration trichrome de Gomori et une zone mélangée avec une activité enzymatique diminuée ou/et augmentée aux colorations oxydatives (fichier additionnel 1 : Fig. S7). Ces altérations structurelles reflètent les modifications observées dans notre modèle de souris (Fig. 4 et Fichier complémentaire 1 : Fig. S7). Nous avons donc comparé notre nouveau modèle de souris et des biopsies musculaires de patients présentant une réduction de la protéine RyR1 et des  » noyaux poussiéreux « . En utilisant le Western blot quantitatif, la quantité de protéines qui étaient clairement modifiées dans notre modèle de souris a également été estimée chez 5 patients atteints d’une maladie récessive de Dusty Core (deux mutations de RyR1 entraînant une réduction de la protéine RyR1 – Fig. 8a). Des biopsies de contrôle d’âge différent (entre 3,5 et 64 ans) ont été utilisées comme référence. Une forte réduction de la protéine RyR1 a été observée chez tous les patients (niveau d’expression moyen 19,8 % ± 2,2 % du CTRL, p < 0,001). De plus, une augmentation de CLIMP63 et de desmine a également été observée. La réduction de RyR1 était associée à une augmentation importante de CLIMP 63 (niveau d’expression moyen multiplié par cinq, 516 % ± 220 %). De plus, le niveau d’expression de la desmine a également augmenté de manière drastique chez les patients par rapport au contrôle (augmentation moyenne du niveau d’expression de 240 fois, 24 170 % ± 7 635 %). En utilisant la microscopie électronique pour analyser l’ultrastructure de la biopsie du patient, de nombreux empilements de membranes ont été observés dans les régions désorganisées (Fig. 8c, flèches) de tous les patients. Ces régions, similaires aux empilements observés dans le muscle RyR1-Rec (Fig. 4b), ont mis en évidence un mécanisme commun, tant chez la souris que chez l’homme, conduisant à la formation de ces structures suite à la réduction de RyR1. Avec des modifications identiques à celles des patients atteints de la maladie de Dusty Core, ce modèle constitue donc un modèle pertinent pour étudier les mécanismes physiopathologiques.

.