Stammer af Streptococcus pyogenes fra Alvorlige invasive infektioner binder HEp2- og HaCaT-celler mere aktivt end stammer fra ukomplicerede infektioner

Streptococcus pyogenes (gruppe A streptokokker ) er et ætiologisk agens for forskellige sygdomme hos mennesker, herunder faryngitis, pyodermi og alvorlige invasive sygdomme. Desuden er patogenet forbundet med potentielt livstruende følgesygdomme som f.eks. poststreptokokkerglomerulonefritis og akut reumatisk feber. I Northern Territory (NT) i Australien er forekomsten af akut reumatisk feber meget høj blandt den indfødte befolkning (3) på trods af en lav isolationsrate af GAS i halsen. Desuden er pyodermi som følge af GAS-infektion ekstremt almindelig, og poststreptokokglomerulonefritis er endemisk i mange fjerntliggende aboriginalsamfund (4, 7). Mens asymptomatisk bæresyge i halsen ofte er det rapporterede reservoir for stammer, der er forbundet med invasiv sygdom (5), er det primære reservoir i befolkninger, hvor impetigo er endemisk, som f.eks. i Aboriginal-samfund i NT, huden. Uanset hvilket væv der er det primære infektionssted, er den første begivenhed, som patogenet skal opnå, adhæsion til værtsceller. S. pyogenes-genomet koder for adskillige gener, der kan betragtes som kodende for adhæsiener. Disse gener er stærkt regulerede, og de enkelte stammer har ikke det genetiske potentiale til at kode for alle disse proteiner. Adhesinerne omfatter M-protein (et anti-fagocytisk molekyle), kapsel- og fibronectinbindende proteiner. Der findes mange forskellige fibronectinbindende proteiner, f.eks. SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2) og SfbII (11). Den enkelte stammes adhæsionsevne kan variere afhængigt af det repertoire af gener for adhesinerne, som stammen besidder, og deres ekspressionsniveau. Dette kan igen afspejle forskellene i evnen til at kolonisere og langvarigt inficere forskellige vævssteder. En konsekvens heraf er, at isolater fra forskellige vævssteder kan udvise forskelle i adhærenskapacitet. For at teste dette har vi bestemt omfanget af binding af GAS-isolater fra hud, hals og blod til HEp2- og HaCaT-cellelinjer, der repræsenterer henholdsvis humane laryngeale epithelceller og keratinocytter.

GAS-isolater fra NT blev indsamlet mellem 1990 og 2002. De 72 stammer, der blev analyseret i denne undersøgelse, blev isoleret fra blod (n = 26), hud (n = 22) og hals (n = 24) (tabel 1). Blodisolater stammede fra alvorlig sygdom, og de resterende stammer stammede fra ukomplicerede infektioner. Isolaterne blev Vir-typet som tidligere beskrevet (6). Vir-typning omfatter restriktionsfragmentlængdepolymorfi af mga-regulonet, som omfatter genet for det meget variable M-protein. For at sikre, at der indgik epidemiologisk ubeslægtede stammer, blev der medtaget et repræsentativt isolat fra hver Vir-type. Kulturerne blev dyrket natten over ved 37 °C i en orbital shaker til stationær fase i Todd-Hewitt-bouillon (Oxoid, Basingstoke, Det Forenede Kongerige) suppleret med 1 % gærekstrakt. For at forberede GAS-inokulumet til adhærensanalyser blev kulturerne centrifugeret natten over, og pellets blev vasket i fosfatbufferet saltvand (PBS; Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) og resuspenderet i serumfrit og antibiotikafrit RPMI 1640-medium (Life Technologies) til en optisk tæthed ved 600 nm på 0,05. Dette svarer til ca. 1 × 107 til 1,5 × 107 bakterier pr. ml.

Humane laryngeale epitelceller (HEp2) blev vedligeholdt i RPMI 1640-medium suppleret med 10 % føtal kalveserum (Life Technologies), 1 % Fungizone (Life Technologies), 20 μg vancomycin HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Australien) pr. ml og 100 μg streptomycinsulfat (Sigma, St. Louis, Mo.) pr. ml. Menneskelige voksne hudkeratinocytter (HaCaT-celler) blev vedligeholdt i Dulbecco’s modificeret Eagle-medium (Life Technologies) suppleret med 10 % varmeinaktiveret føtal kalveserum. Til adhærensanalyser blev ∼105 celler/ml udsået på glascoverlips med en diameter på 12 mm i bunden af vævskulturplader med 24 brønde (Nunc, Roskilde, Danmark). Efter vækst natten over ved 37 °C i 5 % CO2-atmosfære blev cellerne vasket med PBS (pH 7,4) og inokuleret med 500 μl af GAS-inokulumet. Efter 2 timers inkubation ved 37 °C blev dækglassene vasket fem gange ved at tilsætte 1 ml PBS til hver brønd, og efter forsigtig omrøring blev vaskeopløsningen fjernet ved sugning. Efter fjernelse af de ikke-adhærente bakterier blev værtscellerne og de adhærente bakterier fikseret med 95 % methanol og lufttørret. Efter varmefiksering blev dækglassene anbragt på objektglas og Gram-farvet til visning under olieinddypning. I hvert forsøg blev celler i flere tilfældige felter analyseret, og vedhæftning blev udtrykt som det gennemsnitlige antal GAS-kæder pr. celle. Alle analyser blev udført i to eksemplarer, og den gennemsnitlige binding blev bestemt for hver stamme. Alle statistiske analyser blev udført med Stata Statistics/Data Analysis program version 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). Data blev analyseret med t-tests.

GAS-stammer klæbede sig til begge celletyper, og graden af binding varierede fra stamme til stamme (tabel 1). Der var en god korrelation mellem uafhængige eksperimenter med 20 isolater gentaget med to tidsintervaller (data ikke vist), hvilket tyder på, at bindingens aviditet er reproducerbar og stamme-specifik. Samlet set er GAS-bindingen til HaCaT-celler større end til HEp2-celler (P < 0,05). Når dataene i tabel 1 blev adskilt på grundlag af det sted, hvor vævet blev isoleret, blev der i gennemsnit 270 kæder af GAS-stammer fra blod bundet til 50 HaCaT-celler (fig. 1). I modsætning hertil bandt hud- og halsisolater i gennemsnit kun henholdsvis 169 og 178 kæder pr. 50 HaCaT-celler. Disse forskelle er statistisk signifikante (P = henholdsvis 0,0044 og 0,0063). Interessant nok er forskellene for HEp2-celler mindre udtalte og ikke statistisk signifikante. Da dataene imidlertid blev genanalyseret på grundlag af invasive versus ukomplicerede infektioner ved at kombinere data for hud- og halsisolater, blev der fundet signifikante forskelle mellem de to kategorier i begge cellelinjer (P = 0,0011 for HaCaT; P = 0,0238 for HEp2).

Et tidligere arbejde fra dette laboratorium viste, at mange almindeligt cirkulerende stammer af S. pyogenes kunne forårsage invasiv sygdom med huden som det primære infektionssted (1). Disse observationer stemmer overens med de foreliggende resultater af NT GAS-stammernes højere aviditet for HaCaT- end HEp2-cellelinjer og blodisolater, der er i stand til at binde i større antal end isolater fra ukomplicerede infektioner. Mulige forklaringer på S. pyogenes-blodisolaternes høje adhæsionstilbøjelighed omfatter både genotypiske og fænotypiske forskelle mellem isolater fra invasive og ikke-invasive sygdomskilder. Der er behov for yderligere undersøgelser for at definere arten af denne bindingsaviditet og for at afgøre, om den er konsistent inden for klonale populationer.