Materialer og metoder
Deltagere
Projekterne var 83 børn med ADHD (75 % mænd) og 72 TD-børn (51 % mænd) i alderen 6 til 13 år. Inklusionskriterier for ADHD-gruppen var: (a) en klinisk diagnose af ADHD i henhold til DSM-IV-kriterierne, (b) bekræftelse af denne diagnose ved hjælp af Diagnostic Interview Schedule for Children, fjerde udgave, administreret til forældre (DISC-IV-P; ), (c) betydelige ADHD-symptomer, som angivet ved forældrenes vurderinger >90. percentil på mindst en af ADHD-skalaerne (skalaer for uopmærksomhed og hyperaktivitet/impulsivitet) i Disruptive Behaviour Disorder Rating Scale (DBDRS; ), og (d) gennemgribende ADHD-symptomer, som angivet ved lærernes vurderinger >75. percentil på mindst en af ADHD-skalaerne i DBDRS. At have en komorbid diagnose (f.eks. ODD eller ASD) var ikke noget udelukkelseskriterium, og det samme gjaldt behandling med stimulerende medicin. Børn på stimulerende medicin (N = 50, 60 % af ADHD-gruppen) ophørte med at tage medicin 24 timer før testen for at muliggøre fuldstændig udvaskning og under deltagelsen i vores undersøgelse. Inklusionskriterierne for TD-gruppen var: (a) fravær af en klinisk diagnose af nogen udviklings- eller adfærdsforstyrrelse (herunder ADHD og ODD), og (b) score <90th percentil på både forældre- og lærer-rated ADHD-skalaer af DBDRS.
Materialer
Behaviour.
Forældre til børn, der var berettiget til at blive inkluderet i ADHD-gruppen, blev vurderet med afsnittet om forstyrrende adfærdsforstyrrelse i DISC-IV-P. DISC-IV-P er et bredt anvendt standardiseret diagnostisk interview til vurdering af DSM-IV børnepsykiatriske lidelser i barndommen med tilstrækkelige psykometriske egenskaber.
Forældre og lærere til børn i både ADHD- og TD-gruppen udfyldte DBDRS for at vurdere ADHD-symptomer og symptomer på ODD og CD. DBDRS indeholder fire skalaer, der måler symptomer på uopmærksomhed, hyperaktivitet/impulsivitet, ODD og CD på en 4-punkts Likert-skala (fra 0 til 3), hvor en højere score indikerer værre symptomer. Der er rapporteret om passende psykometriske egenskaber for DBDRS .
The Strengths and Weaknesses of ADHD-symptoms and Normal Behaviour rating scale (SWAN; ) blev udfyldt af forældre og lærere for at vurdere symptomer på ADHD. Dette bredt anvendte spørgeskema indeholder to underskalaer; Inattention-skalaen og Hyperaktivitets-/impulsivitetsskalaen, der hver består af 9 emner. Punkterne scorer på en 7-punkts Likert-skala (fra -3 til +3), hvor højere score indikerer værre symptomer. Elementerne er baseret på DSM-IV-symptomerne på ADHD, men afspejler begge ender (stærk og svag) af den adfærd, der er beskrevet i hvert ADHD-symptom. Gennemsnitsscorer på begge underskalaer blev anvendt som afhængige variabler. Der er rapporteret om passende psykometriske egenskaber for SWAN .
ASD-symptomer blev vurderet ved hjælp af den 65-emner store Social Responsiveness Scale (SRS; ), som blev udfyldt af forældre og lærere. Elementerne i SRS er baseret på DSM-IV-symptomdomænerne for ASD, herunder svækkelse i social interaktion, kommunikative underskud og begrænsede/stereotypiske adfærdsmønstre eller interesser. SRS anvender en 4-punkts Likert-skala (fra 0 til 3), og den summerede score på den samlede SRS-skala blev anvendt som afhængig målestok, idet højere score indikerer værre symptomer. SRS har tilstrækkelige psykometriske egenskaber .
Blodpletter.
For at undersøge blodkoncentrationerne af tryptofan, tyrosin og phenylalanin blev der anvendt en teknik med tørrede blodpletter. Indsamling af blodpletter er mindre invasiv for børn end at tage blodprøver fra en blodåre, og teknikken med tørrede blodpletter er tilstrækkelig robust og stabil til diagnostiske formål . Koncentrationerne af AAA i blodpletter er i høj grad korreleret med AAA-koncentrationerne i serum (rs varierer fra 0,86 til 0,96) . Der blev udtaget en blodplet fra hvert barn ved hjælp af en sikkerhedslancet til engangsbrug. Tre bloddråber blev plettet på et blodpletkort. Et 5,5 mm stempel af en tørret blodplet blev blandet med 100μl af en intern standardopløsning (indeholdende 29μM L-phenylalanin-D5, 6μM L-tyrosin-D4 og 5μM L-tryptophan-D5) og 400μl methanol i et gaskromatografiflaske (GC-flaske) og rystet i 15 minutter i et ultralydsbad. Supernatanten blev overført i en anden GC-flaske og inddampet under nitrogen ved 30 °C. Derefter blev prøven butyleret med 100μl 5,5 % acetylchlorid (i n-butanol) ved 60 °C i 15 minutter. Derefter blev butanollaget inddampet under nitrogen (ved 30 °C), og restproduktet blev opløst i 500μl acetonitril. Koncentrationerne af tryptofan, tyrosin og phenylalanin i blodpletterne blev bestemt ved positiv elektrospray-væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS/MS) ved hjælp af et API 3000 triple quadrupol-massespektrometer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), koblet til et højtydende væskekromatografi (HPLC)-system (Perkin Elmer Series 200, Shelton, USA). Tre μl af prøven blev injiceret på en symmetrisk C18-kolonne (3,9*150 mm, 5 μm; Waters, Milford, MA, USA) og elueret med en strømningshastighed på 1 ml/min af 75 % acetonitril (indeholdende 0,4 % myresyre). Tryptofan, tyrosin og phenylalanin elueredes inden for 1 minut og blev målt ved hjælp af overgangene: masse-til-ladningsforhold (m/z) 261,2→159,2 (tryptofan), m/z 238,2→136,2 (tyrosin) og m/z 222,2→120,2 (phenylalanin). Alle opnåede LC-MS/MS-data blev erhvervet og behandlet ved hjælp af Analyst 1.4.2-software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Blodpletkoncentrationerne af tryptofan, tyrosin og phenylalanin blev udtrykt i μmole/L. Pålideligheden af LC-MS/MS blev bekræftet ved at undersøge inter-assay-variansen (som var 5-10 %), intra-assay-variansen (som var 8-10 %) og genfindelsen (som var 90-112 %).
Proteinindtagelse gennem kosten.
Den daglige proteinindtagelse blev vurderet i løbet af tre dage ved hjælp af en ernæringsdagbog, der blev rapporteret af forældrene. Der blev udleveret standardiserede diætoptegnelser og instruktioner. Forældrene blev instrueret i at registrere alle indtagne fødevarer og drikkevarer i kostjournalen og til at udtrykke de indtagne mængder så nøjagtigt som muligt. Proteinindtaget (gram/dag) blev beregnet på grundlag af en computerversion af den nederlandske database over fødevaresammensætning . Den nederlandske fødevaresammensætningsdatabase indeholder over 2000 fødevarer med oplysninger om disse fødevarers ernæringsmæssige sammensætning . Databasen anvendes i vid udstrækning til videnskabelige formål (f.eks.).
Urin.
For at undersøge AAA-koncentrationer i urinen indsamlede deltagerne al urin, der blev udskilt inden for 18 på hinanden følgende timer (efter skoletid), i en urinopsamlingsbeholder. Under urinopsamlingen blev beholderen opbevaret i et køleskab (<5°C). En prøve på 10 ml blev sendt til et laboratorium til analyse, hvor prøven blev opbevaret ved -20°C. Der blev anvendt en HPLC-teknik med fluorescensdetektion til analyse af tryptofan i urinen . Koncentrationerne af tyrosin og phenylalanin i urinen blev bestemt ved hjælp af en Biochrom-aminosyreanalysator . Urinkoncentrationerne af tryptofan, tyrosin og phenylalanin blev udtrykt ved et forhold mellem μmole og det samlede urinvolumen for at udelukke virkninger af polyuri eller oliguri. HPLC-teknikkens pålidelighed blev bekræftet ved at undersøge præcisionen af analyserne, som var 2,25 % for tryptofan (relativ standardafvigelse) og 1,50 % for tyrosin og phenylalanin. Der er høje korrelationer mellem aminosyrekoncentrationerne i 12-timersprøver og 24-timersprøver , hvilket indikerer, at der ikke er nogen døgnvariation i udskillelsen af aminosyrer, hvilket bekræfter brugen af en 18-timersprøve i den aktuelle undersøgelse.
Procedure
Denne undersøgelse er godkendt af den lokale medicinske etiske komité ved VU University Medical Center Amsterdam, Nederlandene (#NL39922.029.12), og er blevet udført i overensstemmelse med de etiske standarder, som er fastlagt i Helsinki-deklarationen fra 1964 og senere ændringer heraf. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra forældrene til alle børn og fra børn ≥12 år før deltagelse. Børn med ADHD blev rekrutteret fra psykiatriske ambulatorier, gennem forældreforeningen for børn med adfærdsproblemer og gennem et forskningswebsted på et universitet. TD-gruppen blev rekrutteret fra grundskoler i hele landet. Børn, der fik stimulerende medicin, ophørte med at tage medicin en dag før deltagelsen (dag 0) for at sikre fuldstændig udvaskning og under vurderingen af blod-, urin- og fødeindtagelse (dag 1 til dag 3). På dag 1 blev blodprøven indsamlet tidligt om morgenen for at udelukke virkningerne af døgnvariationer i AAA-koncentrationerne i blodet. Samme dag, efter skoletid, begyndte urinopsamlingen og fortsatte i de følgende 18 timer, indtil barnet kom tilbage i skole næste morgen (dag 2). Tidligt om morgenen på dag 1 modtog forældrene detaljerede instruktioner om, hvordan de skulle udfylde kostjournalen, og hvordan de skulle indsamle urin fra deres barn. Efter instruktionen begyndte forældrene at registrere deres barns kostindtag, hvilket fortsatte i de følgende tre dage (dag 1 til dag 3). Forældre og lærere blev opfordret til at udfylde spørgeskemaerne på et sikret websted. Alle data blev indsamlet mellem februar 2013 og juli 2014. ADHD- og TD-gruppen blev rekrutteret samtidig for at kontrollere for mulige sæsonbestemte virkninger på fødeindtagelse eller AAA-metabolisme.
Dataanalyse
Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af R, version 3.2.1. Alle variabler blev inspiceret på outliers og manglende værdier for ADHD- og TD-gruppen separat. Winsorising blev anvendt på outliers, disse blev erstattet med en værdi en enhed større (eller mindre) end den foregående mest ekstreme score i fordelingen af gruppen . Manglende data i urinkoncentrationer, kostdata og adfærdsdata blev tilfældigt fordelt og erstattet ved hjælp af gruppens gennemsnit. For blodpletterne var der ingen manglende data. Alle data var normalfordelte, undtagen for CD-symptomer. Gruppeforskelle i køn blev undersøgt ved hjælp af en chi-kvadrat-test, og gruppeforskelle i alder og adfærdsfunktion blev undersøgt ved hjælp af uafhængige t-tests.
For at teste den første hypotese blev gruppeforskelle i AAA-blodpletkoncentrationer vurderet ved hjælp af variansanalyser (ANOVA’er) med gruppe (ADHD eller TD) som fast faktor. Effektstørrelser blev beregnet i form af partiel eta kvadreret og fortolket som små (> .01), mellemstore (> .06) eller store (> .14) . Desuden blev der beregnet odds ratio’er, som udtrykte risikoen for at blive diagnosticeret med ADHD med AAA-koncentrationer under gennemsnittet. Normative data for AAA-koncentrationer blev udledt fra en stor prøve af 6-13-årige børn (N = 104, 52 % mænd) (upublicerede data, prøveoplysninger og resultater kan fås hos forfatterne). For hver AAA blev koncentrationer svarende til den laveste 16. percentil (M-1 SD) i den normative prøve anvendt som en tærskelværdi til at definere AAA-koncentrationer under gennemsnittet (for tryptofan 45 μmole/L, tyrosin 39 μmole/L og phenylalanin 47 μmole/L). Odds ratios blev beregnet med deres 95 % konfidensinterval, og Fisher’s Exact Test blev udført for at undersøge betydningen af odds ratios.
For at teste den anden hypotese undersøgte Pearson produkt-moment korrelationskoefficienter forholdet mellem AAA-koncentrationer i blodpletter og både forældre- og lærervurderede symptomer på ADHD. Størrelsen af korrelationskoefficienter blev fortolket som lille (>.10), middel (>.30) eller stor (>.50) . Data fra ADHD-gruppen og TD-gruppen blev kombineret for at maksimere variabiliteten i målingerne af ADHD-symptomer.
For at teste den tredje hypotese blev der udført korrelationsanalyser mellem AAA-koncentrationer på blodpletter og proteinindtagelse og AAA-koncentrationer i urinen i hele prøven. Vi undersøgte også, om der var gruppeforskelle i proteinindtagelse og urin-AAA-koncentrationer ved hjælp af ANOVA’er med gruppe (ADHD eller TD) som fast faktor. Endelig blev det ved hjælp af korrelationsanalyser vurderet, om AAA-koncentrationer i blodpletterne var relateret til forældre- og lærerrapporterede symptomer på komorbide psykiatriske lidelser (Pearson-produkt-momentkorrelationskoefficienter for ODD og ASD, Spearmans rangkorrelationskoefficienter for CD). Hvis der blev fundet en sammenhæng mellem symptomer på ODD, CD eller ASD og AAA-koncentrationerne, blev tidligere analyser gentaget med disse symptomer indtastet som kovariater. For at korrigere for multiple testning blev alfa-niveauet for korrelationsanalyserne justeret i henhold til Bonferroni-proceduren pr. resultatområde; ADHD-symptomer (12 analyser, således p = .004), potentielle determinanter for AAA-afvigelser i blodpletter (12 analyser, således p = .004) og symptomer på komorbide psykiatriske lidelser (18 analyser, således p = .003). Bonferroni-justerede resultater er rapporteret.