Kopienummeret af methyleret O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase (MGMT) bestemmes i forhold til kopienummeret af beta-actin (ACTB) ved methyleringsspecifik polymerasekædereaktion (MSP) i realtid. Med henblik herpå beriges tumorvævsindholdet ved manuel mikrodissektion efterfulgt af DNA-ekstraktion. DNA kvantificeres ved hjælp af Picogreen og modificeres ved bisulfitbehandling, som bevirker, at umethylerede cytosiner omdannes til uracyl, mens methylerede cytosiner forbliver uændret. Derefter udføres en methyleringsspecifik PCR (MSP) i realtid på Quantstudio 5-instrumentet for at kvantificere antallet af kopier af MGMT og ACTB (1). Denne teknik består i at udføre en PCR med realtidsdetektion ved hjælp af et amplifluordetektionssystem. Prøver med et ukendt antal kopier kan kvantificeres ved sammenligning af deres Ct-værdier med værdierne i en plasmidstandardkurve.
Klinisk betydning
MGMT er et DNA-reparationsenzym, der ofte er deaktiveret ved hypermethylering i human cancer. Når celler mangler MGMT-aktivitet, repareres DNA-skader ikke korrekt, hvilket gør et individ mere tilbøjeligt til at udvikle kræft. Det er interessant, at denne mangel på MGMT-aktivitet også gør en tumorcelle mere følsom over for strålebehandling og visse alkylerende lægemidler som temozolomid (2). I den internationale prognostiske fase III-valideringsundersøgelse (RTOG 0525) lykkedes det MGMT-assayet at identificere nydiagnosticerede glioblastompatienter, som har større sandsynlighed for at leve længere og have en længere progressionsfri periode efter behandling med temozolomid (3-5). For nylig blev der offentliggjort en ny publikation, hvori både methylerede og “gråzone”-patienter klarede sig betydeligt bedre med hensyn til den samlede overlevelse end virkelig umethylerede patienter (6).
Prøvekrav
Acceptable prøver til assayet er formalinfikserede, paraffinindlejrede gliomvævsprøver med en fiksationstid på 6-48 timer.
Volumen
Et repræsentativt paraffinblok foretrækkes. Alternativt accepteres 5 ufarvede vævsafsnit (1 objektglas med en tykkelse på 5 µm til H&E-farvning og mindst 4 objektglas med en tykkelse på 5-10 µm til MGMT-testning).
Opbevarings- og forsendelsesanvisninger
Prøverne skal opbevares og sendes ved omgivelsestemperatur.
Begrænsninger
For nogle prøver vil der blive opnået et ugyldigt resultat på grund af et utilstrækkeligt antal ACTB-kopier i kombination med et antal MGMT-kopier under detektionsgrænsen. Dette kan for det meste forklares ved utilstrækkelig DNA-mængde og/eller -kvalitet. For ugyldige prøver med et kopiantal for MGMT og/eller ACTB omkring LOD/LOQ- og grænseværdien anbefales det at udføre en ny test med udgangspunkt i det bisulfitbehandlede DNA. Andre fiksationsmidler end formalin eller forlænget fiksationstid kan give anledning til utilstrækkelige resultater.
Særlige krav
Ingen
Turn-Around Time
Fem til syv arbejdsdage for henholdsvis objektglas og paraffinblokke.
- Vlassenbroeck I et al. Validering af realtidsmethyleringsspecifik PCR til bestemmelse af O6-Methylguanin-DNA Methyltransferase Gene Promotor Methylering i Gliom. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT-gen-silensering og fordel af temozolomid i glioblastom. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-dense temozolomide for newly diagnosticed glioblastoma: a randomized phase III clinical trial.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomid versus standard 6-ugers strålebehandling versus hypofraktioneret strålebehandling hos patienter ældre end 60 år med glioblastom: det nordiske randomiserede fase 3-studie. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomid kemoterapi alene versus strålebehandling alene til malignt astrocytom hos ældre: NOA-08 randomiseret, fase 3 forsøg. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide (MGMT Promotor Methyleringsgrænse med sikkerhedsmargin til udvælgelse af Glioblastompatienter til forsøg, der udelader Temozolomid). En sammenlagt analyse af fire kliniske forsøg. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Opdateret den 23. maj 2019