Mekanisme for synergistisk depolymerisering af spidse ender af aktinfilamenter ved hjælp af cyclase-associeret protein og cofilin

DNA-konstruktioner

Alle musen N-CAP-proteiner, N-CAP-GFP, fuld længde CAP1, HFD-domænet, GST-fusion af HFD-domænet og det C-terminale ADF-H-domæne af twinfilin, blev klonet ind i pSUMOck4-bakterieekspressionsvektor (en venlig gave fra Inari Kursula, Universitetet i Bergen, Norge) for at udtrykke et SUMO-mærket fusionsprotein, der efterlader en naturlig N-terminus efter spaltning med SENP2-protease. Til CARP-domænet og C-CAP-konstruktionerne anvendte vi pCoofy18-bakterieekspressionsvektor (en venlig gave fra Addgene). For nærmere oplysninger om proteinkonstruktionerne og de primere, der er anvendt til kloning af konstruktionerne, se supplerende tabel 2.

Ekspression og oprensning af CAP-proteiner og dets fragmenter

Alle mus CAP-proteiner og dets fragmenter, undtagen CAP1 i fuld længde, blev udtrykt ved +22 °C i LB auto-induktionsmedie (AIMLB0210, Formedium) i 24 timer i BL21(DE3) E. coli (fra Novagen).

Mus CAP1 i fuld længde blev udtrykt i LB-medium ved hjælp af ArcticExpress (DE3) E. coli-celler. Først inokulerede vi en starterkultur indeholdende kanamycin (20 µg/ml) og gentamycin (20 µg/ml), som blev inkuberet i 6 timer ved +37 °C. Den 3,6 l store hovedkultur, der kun indeholder kanamycin (20 µg/ml), blev inokuleret og dyrket til OD600 på ~0,4 ved +37 °C under omrystning ved 240 rpm. Dyrkningstemperaturen blev ændret til +13 °C i 1 time før proteinekspression, der blev induceret ved tilsætning af 0,26 mM IPTG i 46 timer. Alle bakteriepellets blev opsamlet ved centrifugering, resuspenderet i 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5, snap-frosset med flydende N2 og opbevaret ved -80 °C.

Alle CAP-proteiner og ADF-H-domænet af twinfilin blev oprenset ved hjælp af et lignende arbejdsforløb. Først blev bakterier lyseret ved sonicering i nærværelse af lysozym (0,5 mg/ml), DNAse (0,1 mg/ml) og proteaseinhibitorer (200 µg/ml PMSF, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml aprotinin, 1 µg/ml pepstatin A; alle fra Sigma-Aldrich), og lysatet blev klaret ved centrifugering. Supernatant blev indlæst i en 1 ml HisTrap HP Ni-NTA-kolonne (GE Healthcare) og vasket grundigt (>20 kolonnevolumener) med 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5. Protein blev elueret med 25-250 mM imidazolgradient på AKTA Pure-maskine (GE Healthcare). Peakfraktioner blev samlet, og SENP2-protease blev tilsat til en slutkoncentration på 40 µg/ml til fjernelse af SUMO-tag’et. Blandingen blev dialyseret O/N ved 4 °C ved hjælp af SnakeSkin dialyseslanger i 1 l 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,4 buffer. Næste dag blev de spaltede SUMO-tags fjernet med Ni-NTA agaroseperler (Qiagen) i de tilfælde, hvor SUMO-tag og det spaltede protein var lige store. Proteinerne blev koncentreret med Amicon Ultra-4 10 kDa centrifugalfilter (Merck) og indlæst i HiLoad 16/600 Superdex 200 gelfiltreringskolonne (GE Healthcare), som blev afbalanceret i 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4. Peakfraktioner blev opsamlet, koncentreret og frosset ved hurtig nedfrysning i N2 til opbevaring ved -80 °C.

Den fulde længde CAP blev oprenset med følgende undtagelser. Vi brugte en 5 ml HisTrap HP Ni-NTA-kolonne på 5 ml i stedet for 1 ml kolonne. Efter dialyse og gelfiltrering med HiLoad 16/60 Superdex 200 gelfiltreringskolonne blev de vigtigste peakfraktioner kørt gennem Superose 6 increase 10/300 GL gelfiltreringskolonne for at opnå en bedre adskillelse af blandingen af oligomeriske tilstande. Endelig blev de største toppe fra flere kørsler kombineret, koncentreret med 5 minutters spinintervaller ved hjælp af Amicon Ultra-4 30 kDa centrifugalfilter og opbevaret som ovenfor. CARP- og C-CAP-proteiner blev oprenset som ovenfor med undtagelse af brug af 3C-protease (0,01 mg/ml) til tag-spaltning.

Andre proteiner

Rabbit muskelaktin, mærkede aktiner, profilin, musekofilin-1, capping-protein og biotin-gelsolin blev fremstillet som beskrevet i ref. 16. ADP-actin blev fremstillet som beskrevet i ref. 34. Kort fortalt blev 30 µM ATP-G-actin-opløsning indeholdende 0,3 mM glukose og 1 enhed/ml hexokinase (Sigma) dialyseret mod nukleotidudvekslingsbuffer (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) i 4 timer ved 4 °C. Alle eksperimenter blev udført med kaninmuskel α-actin.

Actin spidsende depolymeriseringsassays

Måling af actinfilamentets spidsende depolymeriseringshastighed blev udført ved hjælp af en mikrofluidisk enhed parret med en mikroskopiopsætning, som beskrevet16. Kort sagt forberedte vi et kammer med polydimethylsiloxan (PDMS, Sylgard), som blev monteret på et rengjort dækglas. De mikrofluidiske kamre var 20 µm høje. De tre indløb og udløbet var forbundet med trykregulerede rør fyldt med opløsninger af forskellig biokemisk sammensætning (Fluigent mikrofluidikanordning).

Efter montering blev kamrene skyllet med dH20 og F-buffer (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT og 1 mM DABCO). Kammeret blev derefter successivt udsat for: 150 µl af 0,1 % biotin-BSA i F-buffer; 300 µl af 5 % BSA; 150 µl af 3 µg/ml neutravidin i F-buffer; og 10-100 µl af 1-3 pM biotin-gelsolin. Før eksperimenterne blev aktinfilamenter polymeriseret (8 µM, >30 min) i F-buffer. En fraktion af aktin-monomerer blev mærket med Alexa-488 eller 568. Filamenter blev endelig injiceret i kammeret og forankret til dækglasset med gelsolinerne indtil ønsket tæthed.

For at måle depolymeriseringshastigheden af cofilin-dekorerede spidse ender blev filamenter først mættet med 2 µM cofilin og udsat for 2 µM cofilin suppleret med forskellige CAP-proteiner. Depolymeriseringshastigheden blev analyseret med ImageJ, idet der først blev lavet en kymograf for hvert filament (funktion reslice) og manuelt tilpasset en hældning langs den spidse ende. Filamenter, hvis spidse ender ikke kunne spores tydeligt eller havde mulige (u)observerede pauser53 eller afbrydningshændelser blev udeladt fra analysen.

For at minimere effekten af proteinmærkning på vores målinger brugte vi enten 10% eller 16% mærkning fraktion af actin afhængigt af mikroskopiopsætningen. Vi observerede ikke virkninger af mærkningsfraktion for N-CAP-aktivitet i vores eksperimenter. Alle eksperimenter blev udført ved stuetemperatur i en ikke-temperaturstyret opsætning.

Reannealing af aktinfilamenter

Fremstillede, steady-state F-actinopløsninger (i F-buffer) med forskellige fluorescerende etiketter blev blandet og inkuberet for at kvantificere reannealing. Den blandede opløsning indeholdt 4 µM Alexa568-actin (10% mærket) og 4 µM Alexa488-actin (10% mærket), med eller uden N-CAP og mutanter. Efter 4 min. ved stuetemperatur blev den blandede F-actinopløsning fortyndet 100× i buffer suppleret med 0,2 % methylcellulose, og den flød ind i et åbent kammer fremstillet med dobbeltklæbende tape, der var anbragt mellem to dækglas, og passiveret med BSA. Der blev optaget billedserier (2 s interval) i mindst tre forskellige synsfelt. Antallet af grønne (Alexa488) F-actinsegmenter blev talt, samt antallet af disse segmenter, der var forbundet med et rødt (Alexa568) F-actinsegment, med henblik på at bestemme forholdet mellem to farvesegmenter, der er plottet i fig. 2f. Ved at overvåge filamenternes diffusion kunne vi utvetydigt bestemme, hvornår to segmenter var forbundet. Kontroller (uden N-CAP i F-actin-blandingen) blev gentaget flere gange, og eksperimenter (med N-CAP eller mutanter) mindst to gange.

Actin severing assays

For at undersøge N-CAP’s indvirkning på cofilins severing anvendte vi to forskellige metoder, enten (1) ved at måle fraktionen af enkelte cofilindomæner, der endnu ikke har ført til en severing, eller ved (2) at kvantificere det globale antal severingshændelser pr. µm aktinfilament.

(1) Severing forbundet med enkelte cofilindomæner (Supplerende fig. 3c). Vi fulgte den tidligere beskrevne procedure16. Kort sagt, inde i et mikrofluidisk kammer blev 12 % Alexa-488-mærkede aktinfilamenter polymeriseret fra spectrin-aktinfrø, der blev forankret uspecifikt til et BSA-passiveret dækglas. Filamenterne blev lagret i 15 minutter med en opløsning af G-actin ved kritisk koncentration (100 nM G-actin), således at filamenterne bliver >99% ADP46. Filamenter blev derefter kontinuerligt eksponeret for 500 nM mCherry-cofilin-1 alene, med 2 µM fuld længde CAP1 eller med 10 µM N-CAP. På ImageJ blev der derefter konstrueret kymografier af filamenterne for at følge kernedannelsen og samlingen af enkelte cofilin-domæner og afbrydelseshændelser ved grænsefladen med nøgne actinsegmenter.

For hvert domæne blev tid 0 defineret ved den ramme, hvor de dannede kerne. Vi registrerede derefter enten det tidspunkt, hvor de inducerede en afbrydelseshændelse, eller når de forsvandt på grund af af afbrydelse af et andet domæne, sammenlægning eller censoreringshændelse. Fraktionen af domæner, der ikke har induceret en afbrydelseshændelse, blev derefter beregnet ved hjælp af en klassisk Kaplan-Meier-metode.

(2) Samlet antal afbrydelseshændelser/µm (Supplerende fig. 3d). Inde i flowkamre (mellem to dækglas, der er adskilt af dobbeltklæbende tape, injicerede vi først præpolymeriserede Alexa-488-mærkede filamenter (i F-buffer, med 0,2-0,3% Methylcellulose). Opløsningen blev derefter udskiftet med 500 nM umarkeret cofilin-1 og 0, 1 eller 10 µM NCAP. Efter udskiftningen blev filamenter, der forblev i nærheden af overfladen, analyseret på følgende måde.

Antal af afskæringshændelser pr. µm blev beregnet som den kumulative funktion

hvor Nsev(u) er antallet af afskærende hændelser på tidspunktet u, og \(\mathop {\sum}\nolimits_i {l_{i(u)}}\) er summen over alle filamenter i af deres længde på tidspunktet u. Da opløsningen ikke indeholder G-actin, depolymeriseres filamenterne, og filamentlængden aftager således over tid.

Binding af N-CAP til filamenternes spidse ender

Eksperimentet blev udført i flowkamre (se Actin severing assay (2))), passiveret med biotin-PLL-PEG og funktionaliseret med neutravidin. F-actin (10% Alexa-568, 1% biotin) blev polymeriseret natten over ved 4 µM. Lige før injektion i kammeret blev F-actin fortyndet ned til 200 nM og blandet med 100 nM N-CAP-GFP, 2 µM cofilin-1 og 4 nM capping-protein i F-buffer suppleret med 0,2 % methylcellulose. Billeder af aktinfilamenter blev optaget før og efter en streamoptagelse af GFP-kanalen (5 billeder/sekund over 12 s, TIRF-mikroskopi). Til analyse af binding til filamentenderne blev actinfilamenter, der ikke bevægede sig under streamoptagelsen, blindt udvalgt. Fluorescensen blev målt på de to ender af hvert filament på et område på 3 x 3 pixels. Der blev registreret en bindingshændelse, når fluorescensen overskred en vilkårlig tærskelværdi (samme værdi for alle filamenter og filamentender). Da afdækningsproteinet skulle beskytte den barberede ende, blev den spidse ende henregnet til den med flest bindingsbegivenheder. N-CAP-GFP blev påvist i 17 % af datapunkterne ved filamentets spidse ende, mens uspecifik binding af N-CAP-GFP i nærheden af filamentets barberede ende blev påvist i 1,7 % af datapunkterne. Overlevelsesfraktionen af N-CAP ved den spidse ende blev derefter beregnet og tilpasset med en enkelt eksponentiel for at måle ubindingshastigheden.

Krystallisering og strukturbestemmelse

Mus HFD-domænet blev krystalliseret med 10×His-tag til stede og oprenset som beskrevet ovenfor, med undtagelse af anvendelse af 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5 buffer i gelfiltrering. Prøven blev koncentreret til 7-10 mg/ml før krystallisering og blandet 1:1 med 0,1 M natriumcacodylat, 12% PEG4000 (w/v), pH 6,1 i ved hjælp af en siddende dråbe-metode med en dråbestørrelse på 200 nl i 96-well-format. Efter 2 ugers inkubation blev der observeret store nåleformede krystaller. Med henblik på fjerndataindsamling ved Diamond Light Source (UK, Didgot) på beamline I03 blev krystallerne kryobeskyttet ved at lægge dem i blød i modervæske indeholdende 25 % glycerol og hurtigt frosset ned i N2 med henblik på forsendelse til beamline. Dataene blev indsamlet ved 100 K med en bølgelængde på 0,9763 Å, Pilatus3 6M-detektor, 30 % transmissionseffekt, 0,05 s eksponering og 0,1° svingningsvinkel i alt 2400 billeder. Diffraktionsdataene blev integreret og skaleret med X-ray Detector Software (XDS)54. Den oprindelige løsning blev opnået med molekylær udskiftning ved hjælp af PHASER55 og PDB = 1s0p som søgemodel. Der blev fundet en løsning med fire HFD-domæner i en asymmetrisk enhed, hvorefter flere runder af raffinering med BUSTER56 og manuel opbygning i COOT57 gav en god tilpasning til dataene (se tabel 1). Der blev opnået yderligere forbedringer ved at forfine dataene med indførelsen af translation-liberation-screw-parametre (1/kæde), fjernelse af ikke-krystallografiske begrænsninger og individuel atomar B-faktor-modellering. Den endelige Rwork/Rfree for modellen var 18,6%/23,0% med god samlet geometri.

Til krystallisering af det tredelte kompleks (af ADP-actin, HFD-domæne af mus CAP1 og C-terminalt ADF-H-domæne af mus twinfilin-1) blev ADP-actin fremstillet i O/N-dialyse ved +4 °C i 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM glukose, 0,5 mM β-mercaptoethanol, pH 8,0. Actinopløsningen, der indeholdt 0,3 mM glucose og 5 U/ml hexokinase, blev overført til en Slide-A-Lyser dialysemembran og anbragt på en flydeanordning ved +4 °C. Næste dag før kompleksdannelsen blev aktin centrifugeret i 20 minutter ved 355 040 × g med TLA-120-rotor i 20 minutter. Proteinerne blev blandet i forholdet 1:1,1,1:1,1 (actin, HFD-domæne, ADF-H-domæne), koncentreret til 10-20 mg/ml og anvendt til krystallisering som ovenfor. Der blev opnået hits fra flere forskellige betingelser, og den bedst diffrakterende krystal blev opnået ved ~10 mg/ml koncentration af komplekset blandet 1:1 i 0,1 M HEPES, 0,1 mM KCl, 10% PEG4000 (w/v), pH 7,0 med en siddende dråbestørrelse på 200 nl. På den første dag dukkede der flere små diamantformede krystaller op i dråben. På tredjedagen dukkede der en stor stavformet krystal op, mens alle de små krystaller blev opløst. Med henblik på fjerndataindsamling ved Diamond Light Source (UK, Didgot) på beamline I03 blev krystallerne kryobeskyttet ved at lægge dem i blød i LV CryoOil (MiTeGen) og frosset ned i N2 med henblik på forsendelse. Dataene blev indsamlet ved 100 K med en bølgelængde på 0,9762 Å, Pilatus3 6M-detektor, 20 % transmissionseffekt, 0,05 s eksponering og 0,15° svingningsvinkel som i alt 2400 billeder. Diffraktionsdataene blev integreret og skaleret med XDS54. En indledende løsning blev opnået med molekylær udskiftning ved hjælp af PHASER55 og PDB = 3daw som søgemodel, der viste en tydelig ekstra tæthed i den spidse ende af actin-monomeren. Der blev således foretaget endnu en molekylær udskiftning, og en indledende model for det tredelte kompleks blev opnået ved hjælp af BALBES58 med 3daw og 1s0p som søgemodeller. Dette gav en løsning med Q = 0,787 og Rwork/Rfree = 29,7 %/35,6 %. Den asymmetriske enhed indeholdt et enkelt 1:1:1:1-kompleks af HFD:ADF-H:ADP-actin. Flere runder af raffinering med BUSTER56 og manuel opbygning i COOT57 , især genopbygning af D-loop og forbindelsessløjfer af α-helices i HFD-domænet, var nødvendige for at forbedre modellen. Endelig gav tilføjelse af vand, indførelse af translation-libration-skrue-parametre (1/kæde) og individuel atomar B-faktor-modellering en model med en endelig Rwork/Rfree på 16,6%/19,4% med god samlet geometri.

Undersøgelse af protein-protein-interaktioner ved gelfiltrering

Til undersøgelse af actin-monomerbinding blev ADP-G-actin fremstillet som beskrevet i ref. 34. Alle gelfiltreringseksperimenter blev udført ved +4 °C med 0,5 ml/min løbehastighed og 0,5 ml fraktionering med Superdex 200 increase 10/300 GL gelfiltreringssøjle equilibreret i 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4. Et hundrede mikroliter kompleks indeholdende 18 µM ADF-H-domæne af twinfilin og 15 µM andre proteiner blev injiceret i kolonnen og analyseret for eluering. Peakfraktioner blev også analyseret ved SDS-PAGE. Konkurrenceforsøg med aktin-monomerkonkurrence blev udført som ovenfor, idet prøverne blev tilsat 15 µM C-CAP- eller CARP-domæne. Peakfraktioner blev analyseret på SDS-PAGE, geler blev afbildet med ChemiDoc XRS +-billeddannelsessystemet (Bio-Rad) og kvantificeret ved hjælp af Image Lab (Bio-Rad).

Native-PAGE

Mini-Protean TGX 10%-geler (Bio-Rad) blev forudkørt i afkølet kørselsbuffer (25 mM Tris, 195 mM glycin, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) i 1 time inden indlæsning. Prøverne blev forberedt i ADP-actin-dialysebuffer (5 mM HEPES eller Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glukose, 0,1 mM DTT, pH 8.0) i 20 µM koncentration af hvert protein, blandet i forholdet 1:1 med 2× loading buffer (running buffer indeholdende 20 % glycerol, bromophenolblåt, ingen ADP eller MgCl2) og derefter påført 5 µl volumen til 50 µl prøvebrønde. Gelerne blev kørt ved 100 V på is i 4 timer.

Fluorometrisk actinfilamentafmonteringstest

Den stationære afmontering af ADP-actinfilamenter blev udført som følger:

Den stationære afmontering af ADP-actinfilamenter blev udført som følger: Det er en af følgende fremgangsmåder: 5% pyren-actin blev polymeriseret i 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4 i 60 min. Filamentets barberede ender blev dækket med 50 nM capping protein. Derefter blev der tilsat 0,5 µM cofilin (og 0,5 µM N-CAP), og reaktionen blev startet ved at tilsætte 4 µM D-vitaminbindingsprotein (monomer-sekventeringsmiddel). Den endelige koncentration af actin var 2,5 µM. Actinafbrydelsen blev målt ved at følge pyrenfluorescens med excitation ved 365 nm og emission ved 407 nm på fluorescensspektrofotometeret (Agilent) i 2400 s ved 22 °C.

CD-spektrometri

CD-spektrene for N-CAP-wildtypen, mutanterne og HFD-domænet blev målt ved 20 °C med J-720-spektropolarimeteret (Jasco) i 300 µl kvartskuvette med 0,1 cm lysvejslængde med følgende parametre: fortsat scanningstilstand med en scanningshastighed på 50 nm/min, båndbredde 0,5 nm, bølgeområde 190-260 nm, dataafstand 0,5 nm. Alle proteinerne blev fortyndet til 15 µM med 10 % PBS-buffer. Akkumulation af ti scanninger for hvert protein er blevet plottet som en enkelt kurve.

Modeller til atomistiske MD-simuleringer

De cofilin-dekorerede actin-modeller var baseret på den kryo-elektronmikroskopiske struktur med en opløsning på 3,8 Å (PDBID: 5YU8)41. De manglende loops blev opbygget ved hjælp af RosettaCM59 og RosettaScripts60 i nærvær af elektrondensitetskortet41 , der pålægger den tilhørende helikale symmetri. For at matche de eksperimentelle konstruktioner i dette arbejde blev actin- og cofilin-sekvenserne i denne fase ændret fra hønse- til henholdsvis kanin- og musesekvenser. Der blev genereret over 1000 modeller. De blev derefter sorteret på grundlag af deres samlede score, og de modeller, der indeholdt strukturelle artefakter (f.eks. cis-peptidbindinger), blev filtreret fra. Molekylær dynamik (MD)-simuleringer blev iværksat ud fra de tre modeller med den højeste score (Supplerende tabel 1, simuleringer F1-3).

HFD-actin-komplekset blev isoleret fra det krystalliserede HFD-domæne/actin/twinfilin ADF-H-domænekompleks og separat docket på de udvalgte cofilin-dekorerede actinfilamentmodeller beskrevet ovenfor. Til dette formål blev det isolerede HFD-actin lagt oven på hver enkelt spidsende actin-monomer, som derefter blev erstattet med HFD-actin. På denne måde overføres krystalstrukturkonformationen af actin-HFD-dimeren til spidsen af det cofilin-dekorerede actin. De dockingmodeller blev først lokalt raffineret ved hjælp af dockingprotokollen61 efterfulgt af restricted relaxation med fast relax62 protokollen, der er distribueret med Rosetta Software Suite. Denne proces blev anvendt separat for hvert cofilin-dekoreret actinfilament, der blev udvalgt til MD-simuleringer (Supplerende tabel 1, simuleringer C1-3).

Konstruktion af det spidse ende-segment til MD-simuleringer

Hver simulering blev udført på et spidst ende-segment af den udvalgte cofilin-dekorerede actinfilamentmodel, som blev oprettet ved at skære modellen vinkelret på filamentets akse. Skæringsplanet blev valgt således, at fire hele ADP-Mg2+-bundne actin-monomerer og tre hele cofilin-monomerer blev inkluderet inden for segmentet (Supplerende tabel 1, simuleringer F1-3). Segmentet indeholdt også de to HFD-domæner i den spidse ende i de HFD-bundne systemer (Supplerende tabel 1, simuleringer C1-3). Segmentet med den spidse ende indeholdt også flere polypeptidfragmenter fra cofiliner og actiner ved den modhagerede ende (Supplerende fig. 5a). For at bevare deres konformation og position under simuleringerne blev disse afbrudte kæder holdt positionelt fastholdt under hele simuleringen på følgende måde: Et lag af rester ved grænsefladen med resten af det spidse ende segment blev efterladt frit; alle tunge atomer nær skæreplanet og kun backbone tunge atomer for regionerne imellem blev fastholdt med en kraftkonstant på 100 kJ/mol/nm2 (Supplerende fig. 5a). Disse delvist fastholdte polypeptidfragmenter ved modhagerende ende fungerer som en platform under simuleringerne. Denne fremgangsmåde opretholder både den filamentlignende protein-protein grænseflade ved den barberede ende og filamentets orientering under simuleringerne.

Protoneringstilstandene for rester blev bestemt ved neutral pH baseret på pKa beregninger ved hjælp af PROPKA363. Hver actin H73-rest blev methyleret (Nτ-Methyl-l-histidin, HIC), og N-terminalerne af actin, cofilin og HFD blev acetyleret. Topologierne for hvert molekyle i systemerne blev udarbejdet med LeAP-programmet distribueret med ambertools1864 , som derefter blev konverteret til GROMACS-formatet ved hjælp af ParmEd-værktøjet.

Hvert spidsende skive oprettet fra de udvalgte modeller blev placeret i en sekskantet prisme-simuleringsboks med dens lange akse justeret med z-aksen. Kassens dimensioner blev valgt, så der var en mindsteafstand på ca. 17 Å mellem filamentet og hver side af kassen (Supplerende tabel 1). Hvert system blev solveret med 0,15 M NaCl-opløsning med antallet af ioner justeret for at neutralisere systemet.

For produktionskørsler blev der udført stejleste nedstigningsminimering og successive korte equilibreringssimuleringer (i alt ~7 ns) i NVT- og NpT-ensemblerne ved hjælp af Berendsen-termostaten og barostat65. Der blev anvendt harmoniske positionsbegrænsninger på den spidse endeflade under disse udligningssimuleringer. En mindre gruppe af atomer (alle tunge atomer, proteinets rygsøjle og til sidst kun Cα-atomerne) blev begrænset i hver på hinanden følgende equilibreringssimulering med en kraftkonstant på 1000 kJ/mol/nm2.

De systemer, der blev forgrenet fra de andre (Supplerende tabel 1; C1′, C2′. F2′) blev fremstillet ved at foretage den passende ændring (docking eller fjernelse af HFD-domæner), fjerne de overlappende opløsningsmiddelmolekyler (når HFD-domæner blev docket) og genjustere boksstørrelsen og opløsningsmiddelatomer til den nye systemstørrelse. Trinvis NVT- og NpT-ækvilibrering med begrænsninger blev udført som nævnt ovenfor (i alt ~200 ps for simuleringer, hvor HFD-domæner blev fjernet, og i alt ~4 ns, hvor den er docket).

Alle produktionskørsler blev udført for 1-2.5 μs i NpT-ensemblet med kun de førnævnte positionsbegrænsninger på platformsområdet.

Kraftfelter og parametre i MD-simuleringer

Der blev anvendt følgende kraftfelter og parametersæt i MD-simuleringerne: Amber ff14sb66 for proteinerne, TIP3P-modellen67 for vand, det monovalente ion-parametersæt af Joung og Cheatham68 for Na+ og Cl-, en oktaedrisk multisite-ionmodel af Saxena og Sept69 for Mg2+ og et parametersæt for polyphosphorylerede forbindelser af Meagher et al.70 for ADP. Manglende bundne parametre for methylhistidin (Nτ-Methyl-l-histidin, HIC) blev overtaget fra GAFF2-kraftfeltet64. De atomare ladninger blev beregnet efter protokollen af Duan et al.71 R.E.D.III.5 software72 blev anvendt til multiconformation restrained electrostatic potential (RESP) fitting ved hjælp af en udvidet og en α-helikal konformation af HIC-dipeptidet (Ace-HIC-Nme). Alle kvantekemiske beregninger blev udført ved hjælp af programpakken Gaussian0973 på teoriniveauet b3LYP/cc-pVTZ. Ladningsberegninger blev udført med IEFPCM-modellen i et polariserbart kontinuum med en dielektrisk konstant på 4 ved at indstille opløsningsmidlet som ether.

MD-simuleringsprotokoller

Alle simuleringer blev udført ved hjælp af GROMACS 2018 74. Bevægelsesligningerne blev integreret ved hjælp af en spring-frog-algoritme med et tidstrin på 2 fs. Alle bindinger blev begrænset ved hjælp af LINCS-algoritmen75. Simuleringsprotokollerne blev valgt i henhold til ref. 66. Langtrækkende elektrostatiske interaktioner blev behandlet ved hjælp af Ewald-skemaet med glat partikelmaske76 med en realrumsafskærmning på 0,8 nm, en Fourierafstand på 0,12 nm og en interpolation af fjerde orden. Lennard-Jones-potentialet med en cutoff på 0,8 nm blev anvendt til van der Waals-interaktioner. Langtrækkende dispersionskorrektioner blev anvendt for energi og tryk77.

Alle produktionssimuleringer blev udført i NpT-ensemblet. Den spidse endeplade, platformen og opløsningsmidlet (vand og 0,15 M NaCl) blev koblet til separate temperaturbade ved 310 °K ved hjælp af Nosé-Hoover-termostaten78,79 med en tidskonstant på 1,0 ps. Isotropisk trykkobling blev udført ved hjælp af Parrinello-Rahman-barostat80 med et referencetryk på 1 atm, en tidskonstant på 5 ps og en kompressibilitet på 4,5 × 10-5 bar-1.

Analyse af MD-simuleringerne

Alle analyser blev udført ved hjælp af VMD81 og interne scripts. MMGBSA-beregningerne blev udført ved hjælp af MMPBSA.py-softwaren82 , der distribueres sammen med ambertools1864 , og som anvender den modificerede GB-model, der er udviklet af Onufriev et al.83 med 0,15 M saltkoncentration (frames samplet hver 100 ns, idet de første 500 ns af hver simulering blev udeladt).

Strukturelle analyser

For analyse af forskellige aktinstrukturer og deres konformationstilstande, der er præsenteret i Fig. 1d, fulgte vi protokollen af Tanaka et al41,84. med F-actin-strukturen (PDB 6djo) som reference.

Statistisk analyse og reproducerbarhed

Data i fig. 2d, 4b og 4d blev samlet fra flere eksperimenter udført på forskellige dage, og repræsenterer således data fra flere uafhængige eksperimenter. Panelerne 2f, 2g, 2h og 3d viser data analyseret fra et enkelt repræsentativt eksperiment. n beskriver antallet af analyserede filamenter for panelerne 2d, 2f, 2g, 4b og 4d. n i panel 6c svarer til antallet af gange, eksperimentet blev udført.

Eksperimenterne i de supplerende figurer 2a-d, 3c og 6a-d blev udført med lignende resultater mindst to gange. Eksperimenterne i 3d, CARP-domænekonkurrenceeksperimentet i 6a og eksperimenterne under samlingsfremmende betingelser i fig. 7 blev udført én gang.

Rapporteringsresumé

Flere oplysninger om forskningsdesign er tilgængelige i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.