Mål:

1. At skelne mellem de to hovedkategorier af bakterier: Gram-positive og Gram-negative.
2. At forstå, hvordan Gram-farve-reaktionen påvirker Gram-positive og Gram-negative bakterier baseret på de biokemiske og strukturelle forskelle i deres cellevægge.

Klik for at se animationen

Staining er en hjælpeteknik, der anvendes i mikroskopiske teknikker, og som bruges til at forbedre det mikroskopiske billedes tydelighed.Farvestoffer og farvestoffer anvendes i vid udstrækning på det videnskabelige område til at fremhæve strukturen af biologiske prøver, celler, væv osv.

Den mest anvendte farvningsprocedure inden for mikrobiologi er Gram-farven, som blev opdaget af den danske videnskabsmand og læge Hans Christian Joachim Gram i 1884. Gram-farvning er en differentiel farveteknik, der skelner bakterier i to grupper: gram-positive og gram-negative. Proceduren er baseret på mikroorganismernes evne til at bevare farven på de farvestoffer, der anvendes under gramfarvningsreaktionen. Gram-negative bakterier bliver afbleget af alkoholen og mister farven fra den primære farvestof, lilla. Gram-positive bakterier bliver ikke afbleget af alkohol og forbliver lilla. Efter affarvningstrinnet anvendes en modfarve til at give de affarvede gramnegative organismer en lyserød farve.

Figur: Hans Christian Joachim Gram

Vigtigheden af en Gram-farve:

Gram-farven er et meget vigtigt indledende trin i den indledende karakterisering og klassificering af bakterier. Det er også en nøgleprocedure i identifikationen af bakterier baseret på farvningskarakteristika, hvilket gør det muligt at undersøge bakterierne i et lysmikroskop. De bakterier, der findes i et ufarvet udstrygningspræparat, er usynlige, når de betragtes i et lysmikroskop. Når de er farvet, kan bakteriernes morfologi og placering også observeres. Desuden er det også et vigtigt skridt i screeningen af infektiøse agenser i kliniske prøver, f.eks. direkte udstrygninger fra en patient.

Gramfarveproceduren gør det muligt for bakterier at bevare farven på farvestofferne, baseret på forskellene i cellevæggenes kemiske og fysiske egenskaber.

1. Grampositive bakterier: Farver mørklilla på grund af tilbageholdelse af det primære farvestof kaldet Crystal Violet i cellevæggen.

Eksempel: Eksempel: Staphylococcus aureus

Fig: Gram positive bakterier

2. Gram negative bakterier: De farves rødt eller lyserødt, fordi de tilbageholder det modfarvende farvestof kaldet Safranin.

Eksempel: Escherichia coli

Fig: Gram negative bakterier

Bakteriel morfologi:

Bakterier er meget små encellede mikroorganismer, der er allestedsnærværende i naturen. De er mikrometre (1µm = 10-6 m) i størrelse. De har cellevægge bestående af peptidoglykan og formerer sig ved binær spaltning. Bakterier varierer i deres morfologiske kendetegn.

De mest almindelige morfologier er:

Coccus (pleural: Cocci):

Kugleformede bakterier; kan forekomme parvis (diplococci), i grupper af fire (tetracocci), i druelignende klynger (Staphylococci), i kæder (Streptococci) eller i kubiske arrangementer af otte eller flere (sarcinae).

For eksempel: For eksempel: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleural: Bacilli):

Stavformede bakterier; forekommer generelt enkeltvis, men kan lejlighedsvis findes i par (diplo-bacilli) eller kæder (streptobacilli).

For eksempel: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

For eksempel: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleural: Spirilla):

Spiralformede bakterier

Til eksempel: Bacillus cereus, Clostridium tetani

For eksempel: Spirillum, Vibrio, Spirochete-arter.

En del bakterier har andre former som:

Kokobaciller: Langstrakt kugleformet eller ægformet.

Filamentøs: Bakterier, der forekommer i lange kæder eller tråde.

Fusiform: Bakterier, der forekommer i lange kæder eller tråde.

Fusiform: Baciller med tilspidsede ender.

Fig: Forskellige bakteriemorfologier

Gram Stain-mekanisme:

Gram Positiv cellevæg:

Gram-positive bakterier har en tyk netlignende cellevæg, der består af peptidoglykan (50-90% af cellevæggen), som farves lilla. Peptidoglykan er hovedsagelig et polysaccharid, der består af to underenheder kaldet N-acetylglucosamin og N-acetylmuraminsyre. Efterhånden som de tilstødende lag af peptidoglykan dannes, krydsforbindes de med korte kæder af peptider ved hjælp af et transpeptidaseenzym, hvilket resulterer i cellevæggenes form og stivhed. Det tykke peptidoglykanlag i Gram-positive organismer gør det muligt for disse organismer at tilbageholde krystalviolet-jodkomplekset og farvelægger cellerne som lilla.

Lipoteichoinsyre (LTA) er en anden vigtig bestanddel af cellevæggen hos Gram-positive bakterier, som er indlejret i peptidoglykanlaget. Den består af teichoinsyrer, som er lange kæder af ribitolphosphat, der er forankret til lipiddobbeltlaget via et glycerid. Det fungerer som regulator for autolytiske vægenzymer (muramidaser: Bakterieenzymer placeret i cellevæggen, der forårsager opløsning af cellen efter skade eller død.)

Medicinsk relevans af grampositiv cellevæg:

LTA har også antigeniske egenskaber, der stimulerer specifikke immunreaktioner, når det frigives fra cellevæggen efter celledød. Celledøden skyldes normalt lysis induceret af lysozymale aktiviteter, kationiske peptider fra leucocytter eller beta-lactam-antibiotika.

Gram-negativ cellevæg:

Gram-negative bakterier har et tyndere lag peptidoglykan (10 % af cellevæggen) og mister krystalviolet-jodkomplekset under affarvning med alkoholskylning, men beholder modfarvningen Safranin og fremstår således rødlig eller lyserød. De har også en ekstra ydre membran, som indeholder lipider, og som er adskilt fra cellevæggen ved hjælp af et periplasmisk rum.

Medicinsk relevans af gramnegativ cellevæg:

Gramnegative bakteriers cellevæg er ofte en virulensfaktor, som gør det muligt for patogene bakterier at forårsage sygdom. Gramnegative bakteriers virulens er ofte forbundet med visse komponenter af cellevæggen, navnlig lipopolysaccharidet ( også kendt som LPS eller endotoxin). Hos mennesker fremkalder LPS et medfødt immunrespons, der er kendetegnet ved cytokinproduktion og aktivering af immunsystemet. Der opstår betændelse som følge af cytokinproduktionen, som også kan give anledning til værtstoksicitet.

Stainreaktion:

De fire grundlæggende trin i Gram Stain er:

1) Påføring af den primære farvestof Crystal Violet (CV) på en varmefikseret udstrygning af en bakteriekultur.

CV dissocieres i vandige opløsninger til CV+ og Cl – ioner. Disse to ioner trænger derefter gennem cellevæggen og cellemembranen i både Gram-positive og Gram-negative celler. CV+-ionerne interagerer senere med negativt ladede bakteriekomponenter og farver bakteriecellerne lilla.

2) Tilsætning af Grams jod.

Jod (I – eller I3 -) virker som bejdsemiddel og som fældemiddel. Et bejdsemiddel er et stof, der øger cellevæggenes affinitet for et farvestof ved at binde sig til det primære farvestof og derved danne et uopløseligt kompleks, som bliver fanget i cellevæggen. Ved Gram-farvningsreaktionen danner krystalviolet og jod et uopløseligt kompleks (CV-I), som giver udstrygningen en mørk lilla farve. På dette stadium vil alle celler blive lilla.

3) Affarvning med 95% ethylalkohol.

Alkohol eller acetone opløser den ydre lipidmembran hos Gram-negative bakterier, hvorved peptidoglykanlaget blotlægges og cellevæggens porøsitet forøges. CV-I-komplekset vaskes derefter væk fra det tynde peptidoglykanlag, hvorved Gram-negative bakterier bliver farveløse.

På den anden side har alkohol en dehydrerende virkning på cellevæggen hos Gram-positive bakterier, hvilket får porerne i cellevæggen til at skrumpe ind. CV-I-komplekset bliver tæt bundet i den flerlagede, stærkt tværbundne Gram-positive cellevæg, hvorved cellerne farves lilla.

Der skal foretages en omhyggelig affarvning, da der ellers kan ske overaffarvning. Dette trin er kritisk og skal times korrekt, ellers vil krystalvioletfarven blive fjernet fra de Gram-positive celler. Hvis affarvningsmidlet påføres på cellen i for lang tid , vil de Gram-positive organismer fremstå Gram-negative. Underaffarvning opstår, når alkoholen ikke er ladt på længe nok til at vaske CV-I-komplekset ud af de Gram-negative celler, hvilket resulterer i, at Gram-negative bakterier kommer til at fremstå Gram-positive.

4) Modfarvning med Safranin

De affarvede Gram-negative celler kan gøres synlige med en egnet modfarvning, som normalt er positivt ladet safranin, der farver dem lyserøde. Den lyserøde farve, som klæber til de grampositive bakterier, maskeres af den lilla farve fra crystal violet (i sjældne situationer anvendes undertiden basisk fuschin i stedet for safranin).