In vivo RyR1-reduktion i muskler udløser en kerne-lignende myopati

Generering af RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 musemodel

En muselinje med loxP-steder indsat på begge sider af exon 9-11 af RYR1-genet (såkaldt RyR1Flox/Flox) blev parret med muselinjen HSA-Cre-ERT2, der udtrykker den tamoxifen-afhængige Cre-ERT2-rekombinase under kontrol af det humane skeletmuskel α-actin-gen , for at skabe RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2. Tamoxifen-injektion inducerer aktivering af Cre-ERT2-rekombinasen selektivt i skeletmuskulaturen, hvilket resulterer i deletion af exon 9-11 og afbrydelse af RYR1-genet i skeletmuskulaturen med en streng tamoxifen-afhængighed (fig. 1a). Ved fødslen var RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2-musene normale, og ved 2 måneders alderen, når de var unge voksne, blev rekombinationen induceret ved tamoxifen-injektion (fra dette tidspunkt blev de rekombinerede dyr kaldt RyR1-Rec). Molekylære og fysiologiske konsekvenser blev yderligere undersøgt som en funktion af tiden, op til 105 dage efter induktion af rekombination (Fig. 1b). Kontroldyr (CTRL) er kuldsøskende RyR1Flox/Flox (uden HSA-Cre-ERT2-transgenet), der er injiceret med tamoxifen. Den overordnede fænotype hos de rekombinerede mus ved 75 dage er karakteriseret ved en kyfose, der er forbundet med en unormal mobilitet af bagbenene og en vraltende gang. Dyrene er stadig i stand til at stå på bagbenene for at æde, men der blev systematisk givet foderpiller direkte i buret, efterhånden som sygdommen udviklede sig. Efter 105 dage er dyrene stadig mobile i burene, og der er ikke observeret nogen øget dødelighed i forhold til CTRL. Både hanner og hunner var ramt. Den relative mængde RyR1 på mRNA-niveau blev analyseret i quadricepsmusklen hver 15. dag efter rekombinationen ved hjælp af RT-q-PCR i CTRL- og RyR1-Rec-dyrene (fig. 1c). Der blev observeret et hurtigt fald i RyR1 mRNA med et lavt og stabilt niveau på 21% ± 4% af den oprindelige værdi, der blev nået allerede 3 dage efter tamoxifeninjektion. Der blev observeret et fald i alle de testede muskler 75 dage efter rekombinationsinduktion (Quadriceps, tibialis anterior, EDL, soleus, Additional file 1: Fig. S1A). Mængden af RyR1-protein blev yderligere analyseret ved hjælp af kvantitativ Western Blot i homogenater af quadriceps-muskler (Fig. 1d, e). Denne mængde blev gradvist reduceret og nåede ca. 50% af den oprindelige værdi efter 105 dage. Der blev ikke observeret nogen yderligere reduktion i RyR1-protein på længere tid (data ikke vist). Mængden af RyR1-protein blev kvantificeret i forskellige muskelhomogenater 75 dage efter rekombination. Der blev observeret en reduktion i alle de undersøgte muskler, selv om den resterende mængde varierede en smule mellem musklerne, idet den højeste var i interosseus (64 % ± 5 %) og den laveste i soleus (33 % ± 5 %) (Additional file 1: Fig. S1B).

RyR1-Rec-mus viser progressiv reduktion i muskel- og kropsvægt og i muskelstyrke

Følgevirkningerne af RyR1-reduktion blev først undersøgt på hele dyrs niveau. CTRL-dyrene, der oprindeligt havde samme vægt, tog langsomt på i vægt fra 24,4 ± 0,4 til 30,6 ± 0,8 g ved D90, mens RyR1-Rec-dyrene gradvist tabte vægt til 20,6 ± 1,3 g ved D90 (Fig. 2a). Både hanner og hunner blev påvirket og mistede ca. 13 % af deres oprindelige kropsvægt efter 75 dage (Additional file 1: Fig. S1C). Dette er resultatet af et vægttab, der blev observeret i alle musklerne (Additional file 1: Fig. S1D). For at teste den samlede muskelydelse efter RyR1-reduktion blev dyrene udsat for to forskellige styrkeprøver. De fik først lov til at hænge og gribe fat i en krydset overflade med alle fire poter i op til 5 min, idet latenstiden til faldet afspejler muskelkraften. Grebstesten, der blev udført hver uge i 105 dage (fig. 2b), viste, at RyR1-Rec-dyrene begyndte at miste styrke 20-30 dage efter tamoxifeninjektion, da mængden af RyR1 var ca. 75-80 % af den oprindelige værdi, og var ude af stand til at hænge på gitteret ca. 75 dage efter tamoxifeninjektion, da RyR1-mængden havde nået et niveau på ca. 60 %. Muskelstyrken blev også vurderet ved en 6 minutters ikke-invasiv elektrostimuleringsprotokol af gastrocnemius-musklen koblet til anatomisk magnetisk resonansafbildning (MRI) under generel anæstesi. Under elektrostimuleringsprotokollen for CTRL-dyr 30 dage efter tamoxifeninjektion (Fig. 2c, D30) blev der registreret en typisk træningsprofil med en stabil indledende muskelstyrke, som langsomt faldt efterhånden som musklen blev træt. I CTRL-gruppen ved D60 og D90 viste træningsprofilen en forbedret muskelkraft, da dyrene blev ældre (Fig. 2c). I modsætning hertil blev præstationen hos RyR1-Rec-dyrene, som lignede CTRL ved D30, forringet med alderen. RyR1-Rec-dyrene var ikke længere i stand til at udføre øvelsen ved D90 (Fig. 2c, RyR1-Rec D90). Gastrocnemius-volumen målt ved hjælp af MR-billeder (Fig. 2d) forblev stabilt hos CTRL-dyrene fra D30 (161 ± 5 mm3) til D90 (164 ± 4 mm3). I modsætning hertil var gastrocnemius-volumen hos RyR1-Rec-mus signifikant mindre end hos CTRL-mus siden D30 (141 ± 3 mm3, p = 0,003) og blev yderligere reduceret ned til 100 ± 3 mm3 ved D60 (p < 0,001 sammenlignet med CTRL ved samme alder) og 69 ± 4 mm3 ved D90 (p < 0,001 sammenlignet med CTRL ved samme alder). Den maksimale specifikke trækspænding (absolut trækspænding normaliseret til muskelvolumen) bekræfter, at begge grupper udviste samme muskelstyrke ved D30 (fig. 2e), men RyR1-Rec-dyrenes styrke faldt dramatisk, mens den steg hos CTRL-dyrene, efterhånden som de blev ældre. Derudover blev ændringerne i gastrocnemius-muskelbioenergetik under elektrostimulering vurderet noninvasivt ved D60 ved hjælp af in vivo 31-fosfor (31P) MR-spektroskopi (31P) MR-spektroskopi. Mens den basale intramyofibrillære pH ikke var forskellig mellem de to grupper (Yderligere fil 1: Fig. S2A), var omfanget af acidose ved slutningen af træningen lavere (p = 0,016) i RyR1 Rec-dyrene (Yderligere fil 1: Fig. S2B), hvilket tyder på, at glykolytisk flux i træningsmusklen var reduceret i disse dyr. Desuden var tidskonstanten for fosfokreatinresyntese efter træning (τPCr) signifikant kortere (p = 0,047) hos RyR1-Rec-mus (Yderligere fil 1: Fig. S2C, D), hvilket afspejler en forbedret mitokondriefunktion in vivo. Faktisk er PCr-syntese i genopretningsperioden efter træning udelukkende afhængig af oxidativ ATP-syntese, og τPCr betragtes således som et indeks for den oxidative fosforyleringskapacitet . Samlet set tyder disse resultater på, at RyR1 progressiv reduktion er forbundet med et progressivt vægttab og et fald i muskelstyrke.

De fysiologiske egenskaber af isolerede fibre er kompromitteret i RyR1-Rec-mus

Den ændrede muskelfunktion blev yderligere karakteriseret på det enkelte muskelfiberniveau ved hjælp af en kombination af helcelle-spændingsklampning og konfokal billeddannelse . T-tubuli-netværket blev afbildet ved farvning af plasmamembranen med di-8-anepps . Der blev ikke observeret nogen kvalitativ forskel i netværket (Fig. 3a, venstre) eller kvantitativ forskel i den gennemsnitlige T-tubulærtæthed mellem CTRL- og RyR1-Rec-fibre, ud over en lille, men signifikant forkortelse af den gennemsnitlige hvilesarkomerlængde (Fig. 3a, grafer til højre). Den spændingsaktiverede Ca2+-indstrømning gennem DHPR (Fig. 3b-d) og af Ca2+-frigivelsesstrømmen gennem RyR1 (Fig. 3e-i) blev vurderet samtidig. Sammenlignet med CTRL-fibre udviste RyR1-Rec-fibre spændingsaktiverede DHPR Ca2+-strømme med lignende tidsforløb (Fig. 3b), men reduceret tæthed, som vist af den maksimale strømtæthed vs. spænding i de to grupper (Fig. 3c), hvilket oversatte sig til en 30% reduktion i maksimal konduktans (Gmax) uden nogen tilknyttet ændring i de andre parametre i forholdet mellem strøm og spænding (Fig. 3d). Spændingsafhængigheden af SR Ca2+-frigivelse blev vurderet ud fra line-scan-billeddannelse af det Ca2+-følsomme farvestof rhod-2. Line-scan-billeder fra RyR1-Rec-fibrene lignede kvalitativt dem fra CTRL-fibrene (Fig. 3e) og viste en hurtig stigning i fluorescens ved depolarisering af T-tubuli-membranen, der var rumligt homogen langs den scannede linje. Hastigheden af SR Ca2+-frigivelse (Fig. 3g), beregnet ud fra ændringerne i rhod-2 fluorescens fremkaldt af depolariserende impulser af stigende amplitude (Fig. 3f), udviste et lignende tidsforløb i RyR1-Rec-fibre som i CTRL-fibre, men vigtigt er, at peakværdierne var reduceret i RyR1-Rec. Fitting af peakhastigheden af SR Ca2+-frigivelse vs. spænding (Fig. 3h-topgrafen) viste, at den maksimale Ca2+-frigivelseshastighed var reduceret med 25% i RyR1-Rec-gruppen (Fig. 3i, Max), hældningsfaktoren (k) var også let, men signifikant reduceret, mens spændingen for midteraktivering (V0,5) var uændret. Der blev observeret en lille (1,3 ms i gennemsnit), men signifikant stigning i tid-til-top-hastigheden af SR Ca2+-frigivelse i RyR1-Rec-fibrene (Fig. 3h, nederste graf). Der blev ikke observeret nogen ændringer i fibrenes cytosoliske Ca2+-fjernelseskapacitet (SERCA-pumpfunktion), målt med det lav-affinitets Ca2+-følsomme farvestof fluo-4 FF under ikke-EGTA-bufferingsbetingelser (Additional file 1: Fig. S3). Samlet set viser disse resultater, at den 35 % reduktion i RyR1-mængden i interosseous er forbundet med en 30 % reduktion i calciumstrømmen gennem DHPR og en 25 % reduktion i calciumstrømmen gennem RyR1.

RyR1-reduktion påvirker skeletmuskelstrukturen

For bedre at forstå grundlaget for disse funktionelle ændringer, der er forbundet med et fald i RyR1, blev muskelstrukturen undersøgt på RyR1-Rec-dyr ved D75 efter rekombination og sammenlignet med CTRL-dyr. Extensor digitorum longus (EDL), en muskel med hurtige trækninger, soleus, en muskel med langsomme trækninger, og tibialis anterior (TA), en blandet muskel, blev analyseret ved hjælp af hæmatoxylin-eosin-, NADH- og Gomori-trichromfarvninger. Farvninger af TA, der er vist i fig. 4a, viser en unormal muskelstruktur i RyR1-Rec-dyrene uden fibrose eller centrale kerner, men med fiberatrofi, der påvirker både type I- og type II-fibre (tabel 2). En mitokondrier disorganisering karakteriseret ved lokal ophobning/udtømning i tilstødende regioner af samme fiber (pilespids og indsat Fig. 4a) og rød farvningsakkumulering observeret med Gomori-trichrom (Additional file 1: Fig. S4) blev også observeret, hvilket ligner de støvede kerner, der for nylig blev beskrevet hos patienter . Fiberatrofi blev observeret i begge fibertyper i EDL, selv om reduktionen var lidt mere vigtig i type I-fibre (tabel 2). Transversal TA-snit af CTRL- og RyR1-Rec-mus blev farvet med antistoffer mod RyR1 og desmin. Der blev ikke observeret nogen ændring i RyR1-fordelingen mellem type I- og type II-fibre i RyR1-Rec TA-sektioner, hvilket indikerer en lignende RyR1-reduktion i alle fibertyper (Fig. 4b). Overraskende nok blev der observeret en vigtig ændring i desminfordelingen med en stor stigning i de små type I-fibre (Fig. 4b): I CTRL TA-sektioner udviste alle fibre en lignende perifer farvning, mens de små type I-fibre i RyR1-Rec TA-sektioner var stærkt farvede både i fiberperiferien og i cytosolen (indsat Fig. 4b). Selv om IF-mærkningen ikke er kvantitativ, viser disse resultater, at RyR1-reduktionen højst sandsynligt var homogen, uden nogen stor forskel mellem tilstødende fibre som observeret for desmin, idet den kvantificering, der blev udført ved Western Blot, var refleksionen af protein indeholdt i hver fiber og ikke et gennemsnit af fibre med 0 % RyR1 og fibre med 100 % RyR1 inden for den samme muskel.

Triadernes organisation blev yderligere undersøgt ved hjælp af immunofluorescerende mærkning af isolerede EDL-fibre (fig. 5a). Mærkningen af alfa-actinin (som markør for Z-linjen), af triadin og af RyR1 (som triade-markører) på RyR1-Rec EDL-fibre viste, at reduktionen i RyR1-mængden resulterede i en generaliseret desorganisering af fiberen med unormal triade-lokalisering og afbrydelse af Z-linjen, men triadin og RyR1 var stadig delvist kolokaliseret. Selv om triaderne forblev på begge sider af Z-linjen, dannede Z-linjen ikke en lige linje som i CTRL og præsenterede i stedet mange mikroforstyrrelser (indsat Fig. 5a). Musklens ultrastruktur blev analyseret ved hjælp af elektronmikroskopi på RyR1-Rec EDL-fibre ved D75 (Fig. 5b). Nogle regioner havde en relativt bevaret struktur (Fig. 5b, venstre fiber), mens nogle tilstødende regioner var meget uorganiserede, med afbrydelse af sarkomerens regelmæssige organisation, mitokondrier disorganisering og tilstedeværelsen af talrige stakke af membran (Fig. 5b, pile, forstørret i indsat), tidligere kaldet multiple triader . De morfologiske træk ved disse multiple triader sammenlignet med de normale enkelte triader er vist i tabel 3, og yderligere eksempler er vist i Additional file 1: Fig. S5. Præcis kvantificering af den formodede T-tubulibredde, den formodede SR-bredde og intermembranrummet (T-tubuli/SR) (Yderligere fil 1: Fig. S5) viste en enorm stigning i T-tubuliens gennemsnitlige størrelse i disse multiple triader (dobbelt stigning, der nåede 202 % af T-tubuliens størrelse i den normale triade), mens SR’s gennemsnitlige bredde kun steg lidt (+ 10 %), og intermembranrummet ikke blev ændret. Disse resultater peger på en generaliseret strukturel desorganisering af RyR1-Rec-musmuskler forbundet med membranomdannelse.

RyR1-reduktion er forbundet med ændring i mængden af talrige proteiner

Følgevirkningerne af RyR1-reduktion blev undersøgt på molekylært niveau ved hjælp af kvantitativ Western Blot på quadricepsmuskel af CTRL- eller RyR1-Rec-mus (8 dyr i hver gruppe) ved D75 efter tamoxifen-injektion (Fig. 6). Den relative mængde af talrige proteiner, der direkte eller indirekte er involveret i calciumhåndtering, blev estimeret ved at bruge den samlede mængde proteiner bestemt ved farvningsfri evaluering som reference . Der blev ikke observeret nogen forskel i kvantificeringen af RyR1 mellem denne metode og brugen af myosin tung kæde som referenceprotein (sammenligning mellem fig. 1, 6). Der blev ikke observeret nogen signifikant ændring mellem CRTL- og RyR1-Rec-muskler i mængden af triadinisoformen T95, calciumbindingsproteinet CSQ1, Ca2+-ATPasen SERCA, den mitokondrielle FoF1-ATPase og alfa 1-underenheden af DHPR (Fig. 6a, b). Derimod blev der observeret en stigning i mængden af STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), triadinisoformen T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004) og ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017). Da ændring i lokaliseringen af det strukturelle protein desmin blev observeret ved hjælp af immunofluorescensmærkning (Fig. 5b), blev desmin-ekspressionsniveauet også kvantificeret, og der blev observeret en enorm stigning i desmin-mængden (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). Lokaliseringen af CLIMP63 og STIM1 i RyR1-Rec EDL-fibre blev analyseret ved hjælp af immunofluorescerende mærkning, og der blev ikke observeret nogen større ændring (Yderligere fil 1: Fig. S6). Derfor var RyR1-proteinreduktion forbundet med en stigning i forskellige proteiner involveret i calciumregulering eller i muskelarkitektur.

Autofagi er ændret som følge af RyR1-reduktion

Forandring i autofagi er blevet observeret i nogle myopatier . For at identificere de mekanismer, der fører til muskelatrofi som følge af RyR1-reduktion, søgte vi efter ændringer i autofagiflowet i RyR1-Rec-muskler. Mængden af LC3 II, et membranprotein fra autofagosomerne, blev evalueret med kvantitativ Western Blot (Fig. 7a, b), og der blev observeret en stigning i LC3 II (172 % ± 32 %, p = 0,03). Denne stigning i autofagosomer kunne afspejle enten en stigning i dannelsen af autofagosomer (som følge af en stigning i autofagiprocessen) eller et fald i deres fusion med lysosomer (og dermed en hæmning af autofagiafbrydelsen). Den præcise karakter af ændringen af autofagiflowet blev yderligere analyseret ved kvantificering af p62, et velkendt protein, der specifikt nedbrydes via autofagi, hvis mængde også blev signifikant forøget (Fig. 7a, b, 172 % ± 22 %, p = 0,006). Den tilknyttede stigning i LC3 II og i p62 i RyR1-Rec-muskel sammenlignet med kontrol antydede, at RyR1-reduktionen derfor var forbundet med hæmning af autofagiflowet. Desuden blev der observeret en stigning i aktiveringen (fosforylering) af to inhibitorer af autofagi, mTOR og S6-protein (Fig. 7b, c) (P-mTOR/mTOR stigning med 174 % ± 17 %, p = 0,01; P-S6/S6 stigning med 320 % ± 50 %, p < 0,001). Stigningen i fosforylering af disse to autofagihæmmere i RyR1-Rec dyr sammenlignet med kontroller pegede yderligere i retning af en hæmning af autofagi, der er ansvarlig for muskelatrofi i RyR1-Rec dyr.

Biopsier fra menneskelige patienter udviser lignende defekter som dem, der er observeret i RyR1-Rec-mus

I en nylig undersøgelse af en stor kohorte af patienter med en recessiv medfødt myopati , har vi identificeret tilstedeværelsen af atypiske strukturer, kaldet “støvede kerner”, i mere end halvdelen af patienterne med en reduktion i RyR1-mængden. De blev observeret ved flere farvninger og adskiller sig fra den klassiske centrale kerne (veldefinerede områder uden oxidativ farvning) ved deres dårligt definerede grænser, deres fokale myofibrillære desorganisering, en rødlig-lilla granulær materialeaflejring ved Gomori trichrome farvning og blandet område med nedsat eller/og øget enzymatisk aktivitet ved oxidativ farvning (Additional file 1: Fig. S7). Disse strukturelle ændringer afspejler de ændringer, der er observeret i vores musemodel (Fig. 4 og Additional file 1: Fig. S7). Vi sammenlignede derfor yderligere vores nye musemodel og muskelbiopsier fra patienter med en RyR1-proteinreduktion og “støvede kerner”. Ved hjælp af kvantitativ Western Blot blev mængden af de proteiner, der tydeligt blev modificeret i vores musemodel, også estimeret i 5 patienter med en recessiv Dusty Core-sygdom (to RyR1-mutationer, der resulterer i RyR1-proteinreduktion – fig. 8a). Kontrolbiopsier af forskellig alder (mellem 3,5 og 64 år) blev anvendt som reference. Der blev observeret en stor reduktion i RyR1-protein hos alle patienterne (gennemsnitligt ekspressionsniveau 19,8 % ± 2,2 % af CTRL, p < 0,001). Desuden blev der også observeret en stigning i CLIMP63 og desmin. Reduktionen i RyR1 var forbundet med en betydelig stigning i CLIMP 63 (gennemsnitlig stigning i ekspressionsniveauet femdobbelt, 516 % ± 220 %). Desuden var ekspressionsniveauet for desmin også drastisk forøget hos patienterne sammenlignet med kontrollen (gennemsnitlig stigning i ekspressionsniveauet 240 gange, 24 170 % ± 7 635 %). Ved hjælp af elektronmikroskopi til analyse af patientbiopsiens ultrastruktur blev der observeret mange stakke af membraner i de desorganiserede områder (fig. 8c, pile) hos alle patienterne. Disse regioner, der ligner de stakke, der blev observeret i RyR1-Rec-muskel (Fig. 4b), pegede på en fælles mekanisme, både hos mus og hos mennesker, der fører til dannelsen af disse strukturer som følge af RyR1-reduktion. Med identiske modifikationer som hos patienter med Dusty Core Disease udgør denne model således en relevant model til undersøgelse af de patofysiologiske mekanismer.