HE4 som markør for kræft i æggestokke
Eggestokkræft er en relativt håndterbar malignitet, når den diagnosticeres i et tidligt stadium, men opdagelse i et sent stadium medfører næsten altid en dårlig prognose. Forskere har arbejdet ihærdigt på at finde en mere pålidelig biomarkør, der kan bidrage til tidlig påvisning samt til behandlings- og generel sygdomsovervågning. HE4 er blandt de hyppigst opregulerede gener i epitheliale ovariecarcinomer baseret på genekspressionsprofiler. Som beskrevet senere har flere grupper været pionerer i arbejdet med at bestemme HE4’s effektivitet som en molekylær markør for OC.
For at kunne måle serumkoncentrationen af HE4 og efterfølgende bestemme, om den kunne anvendes som en molekylær markør for OC, var det nødvendigt med en HE4-detektionsmetode. Hellstrom og kolleger konstruerede et gen, der koder for HE4 fusioneret med Fc-domæner fra mus eller humane Ig Fc-domæner. Mus blev derefter immuniseret med det af mus afledte Ig Fc-HE4-fusionsprotein. De resulterende hybridomer blev screenet mod det humane Ig Fc-HE4-fusionsprotein, hvorefter der blev genereret to monoklonale antistoffer, som genkendte forskellige HE4-epitoper. De monoklonale antistoffer blev derefter anvendt til fremstilling af en dobbeltbestemmende (“sandwich”) ELISA, som med succes er blevet anvendt til serumdetektion af HE4. Screeningsanalyser i stor skala til evaluering af biomarkører ved hjælp af immunoassays står imidlertid over for store udfordringer, f.eks. krav til mængden af patientprøver, prisen på affinitetsreagenser og den arbejdsindsats, der kræves for at forberede og anvende disse reagenser. I lyset af disse mangler forsøgte Scholler et al. at udvikle en ny type antistof, som kunne afhjælpe udfordringerne. Forfatterne udviklede “biobodies” (Bbs) fra diploid gær, der var transformeret med rekombinant plasmid-DNA, således at Bbs’erne ved sekretion ville blive “bio”-tinyleret. Som følge af denne elegante in vivo biotinyleringsmekanisme undgås kemisk biotinylering, og rekombinante antistoffers påvisningsfunktion ved hjælp af rettet biotinylering bibeholdes. Forskerne udviklede Bbs for HE4 og mesothelin, koblede dem med polyklonale antistoffer og testede deres nøjagtighed i forbindelse med OC-detektion. De sammenlignede resultaterne med dem, der blev opnået ved hjælp af den standard CA-125 dobbeltbestemmende “sandwich-ELISA” og viste, at detektion ved hjælp af Bbs gav samme nøjagtighed som den tidligere test, men krævede betydeligt mindre serum og var betydeligt mere omkostningseffektiv. Forfatterne fandt, at HE4 og mesothelin er mere effektive til påvisning af serøse maligniteter i æggestokkene end de endometrioide, clear cell- eller mucinøse subtyper. I betragtning af, at serøs cellecellulær OC er den mest almindelige form for OC og den mindst sandsynlige form for OC, der diagnosticeres, når den er begrænset til æggestokkene, har markører som HE4 og mesothelin stor betydning for en forbedring af OC-behandlingen.
Flere publikationer har påvist HE4’s overlegenhed i forhold til CA-125 som OC-biomarkør. Specifikt giver HE4’s evne til at skelne benigne sygdomme fra maligniteter (dvs. dens følsomhed) den en fordel i forhold til CA-125 alene i forbindelse med OC-detektion. Faktisk er brugen af CA-125 til påvisning af OC hos præmenopausale kvinder forbundet med en så lav sensitivitet og specificitet, at det næsten udelukkende er forbeholdt anvendelse i postmenopausale tilfælde. Det lykkedes Moore et al. at validere HE4’s supplerende virkning på CA-125’s evne til at påvise OC ved vurdering af effektiviteten af forskellige formodede OC-biomarkører, alene eller i kombination. Præoperative serum- og urinprøver indsamlet fra flere institutter blev screenet for at bestemme niveauerne af CA-125, opløseligt mesothelin-relateret peptid, HE4, CA72-4, activin, inhibin, osteopontin, EGF-receptor og human epidermal vækstfaktorreceptor 2 (HER2 onkogen) hos 259 patienter med adnexale masser, hvoraf 233 var berettiget til analyse (67 invasive epitheliale OC’er og 166 godartede ovarie neoplasmer). Som en enkelt markør havde HE4 den højeste sensitivitet på 72,9 %, når specificiteten blev sat til 95 %. Kombinationen af CA-125 med HE4 opnåede den højeste følsomhed sammenlignet med alle andre enkeltmarkører eller kombinationer af to markører, og tilføjelsen af andre markører til CA-125 plus HE4-panelet medførte kun en beskeden forbedring af følsomheden for påvisning af OC’er. Havrilesky og kolleger opnåede lignende resultater i en uafhængig undersøgelse af en anden gruppe af OC-biomarkører, som omfattede HE4, glycodelin, matrixmetalloproteinase (MMP)7, SLPI, plasminogenaktivator, urokinasereceptor (Plau-R), mucin (MUC)1, inhibin A, plasminogenaktivatorinhibitor (PAI-1) og CA-125. Den prædiktive værdi af enkeltmarkør- og flermarkørpanelet blev vurderet ved hjælp af to forskellige cut-off-punkter bestemt ved hjælp af ROC-kurver (receiver operating characteristic (ROC)), hvoraf den ene var den bedste cut-off, bestemt ved den højeste værdi for sensitivitet plus specificitet, og den anden blev bestemt ved at bruge den øvre grænse på to gange standardafvigelsen for undersøgelsens referencekohorte i overensstemmelse med Clinical and Laboratory Standards Institute. Forfatterne fastslog, at HE4 udviser den højeste sensitivitet blandt alle andre enkeltmarkører til påvisning af både tidlig (62,4-82,7 %) og sen (74,6-92,5 %) OC, uanset hvilken cut-off der blev anvendt. Forskerne gennemførte samtidig en pilotundersøgelse, hvor de vurderede effektiviteten af et bestemt biomarkørpanel (HE4 plus MMP7 plus glycodelin) til overvågning af OC. Dette panel forudsagde tilbagefald før CA-125-forhøjelsen i 56 % af tilfældene.
Huhtinen og kolleger analyserede for nylig serumkoncentrationer af HE4 og CA-125 hos 225 kvinder med OC, EC, endometriose eller sunde kontroller. Kombinationen af HE4 plus CA-125 opnåede en meget forbedret sensitivitet på 92,9 % ved 95 % specificitet sammenlignet med enten HE4 (78,6 % sensitivitet) eller CA-125 (78,6 % sensitivitet) alene. HE4-niveauerne var forhøjede i både endometriale og ovarielle maligniteter, men ikke i endometriotiske læsioner. Disse resultater giver således yderligere beviser for HE4’s komplementære sammenhæng med CA-125 ved påvisning af OC. Det er bemærkelsesværdigt, at denne undersøgelse viste unikke evner hos HE4 og CA-125 til at skelne patienter med malignitet i æggestokkene fra patienter med godartede tilstande i æggestokkene eller endometriet. Forhøjet CA-125 uden HE4-forhøjelse er specifikt indikativ for fremskreden endometriose eller ovarieendometriom. På den anden side kan forhøjet HE4 med normal CA-125 tyde på tilstedeværelsen af enten ovariecancer eller andre typer kræft, herunder EC. Dong et al. fastslog, at HE4 har en fordel i forhold til CA-125 i ROC-areal under kurven (AUC) og sensitivitet med 100 % specificitet, når æggestokkræft blev sammenlignet med raske kontroller eller kvinder med godartede sygdomme. Omvendt havde CA-125-assayet en fordel med hensyn til ROC-AUC og sensitivitet med 100 % specificitet, når æggestokkræft kun blev sammenlignet med raske kontroller. Dette kan tilskrives den drastiske forskel (i forhold til HE4) i CA-125’s ekspression i maligne æggestokssygdomme i forhold til raske kvinder. Selv i denne situation var HE4 plus CA-125-kombinationsassayet stadig overlegen i forhold til CA-125 alene, når OC blev sammenlignet med forskellige kontrolgrupper.
Et ikke-invasivt middel til at skelne mellem maligne bækkenmasser og benigne læsioner er vigtigt, da ca. 20 % af kvinderne vil udvikle en ovariecyste eller bækkenmasse på et tidspunkt i deres liv. Uden passende midler til at skelne mellem disse tumorer og deres ondartede potentiale vil en betydelig del af disse kvinder blive opereret unødvendigt. Da CA-125-overekspression ikke kan påvises i op til 50 % af maligne ovarier i tidligt stadie, vil mange kvinder, der skal opereres, ikke få tilstrækkelig behandling inden for en acceptabel tidsramme, hvis et sådant kriterium anvendes til at bestemme malignitetsstatus, hvis de skal opereres. Et centralt problem, som Moore og kolleger påpeger i en nyere lederartikel, er, at ingen af de i øjeblikket anvendte billeddannelsesteknikker eller biomarkøranalyser i sig selv er i stand til at skelne mellem OC og godartede sygdomme i æggestokkene med en acceptabel sensitivitet og specificitet. MRI-, PET- og CT-scanninger er nyttige til at klassificere kvinder i lav- og højrisikogrupper, men disse undersøgelser er alt for dyre til at blive anvendt til alle kvinder med en cyste i æggestokkene eller en bækkenmasse. I betragtning af strålingseksponeringen og/eller den invasive karakter er det vanskeligt at retfærdiggøre, at disse undersøgelser foretages i den asymptomatiske befolkning. Da urin/serum-baserede analyser er ikke-invasive og relativt billige, ville det være ideelt at have en biomarkør eller et multimarkørpanel med tilstrækkelig sensitivitet og specificitet til at tjene som et redskab til stratificering af OC-risiko. Sofistikerede billeddannelsesteknikker kunne derefter anvendes på de patienter med moderat til høj risiko, der triageres til behandling i centre, der har specialiseret sig i behandling af ovariecarcinom. Fujirebio Diagnostics, Inc. har for nylig udviklet et sådant værktøj, som i væsentlig grad forbedrer differentialdiagnosen af bækkenmasser. Sættet anvender en HE4 plus CA-125-kombinationstest kombineret med en algoritme til beregning af risikoen for malignitet i æggestokkene til at kategorisere kvinder, der præsenterer sig med en bækkenmasse, i grupper baseret på malignt potentiale. Stratificeringssættet identificerede korrekt 91 % af patienterne med epithelial ovariecancer som højrisikopatienter for malignitet, mens 75 % af kvinderne med godartede bækkenmasser blev korrekt henført til lavrisikogruppen. Dette er en betydelig forbedring i forhold til den sensitivitet og specificitet, der kan opnås ved brug af CA-125 alene. Dette kommercielt tilgængelige kit har for nylig fået tilladelse fra den amerikanske FDA til at blive anvendt til påvisning og overvågning af OC i USA.
Og selv om HE4 konsekvent har vist sig lovende som et supplement til CA-125 og andre biomarkører til påvisning/diagnosticering af OC, skal der foretages forbedringer, før en effektiv screeningstest for hele befolkningen kan realiseres. I betragtning af OC-prævalensen på kun én ud af 2.500 postmenopausale kvinder i USA ville en acceptabel screeningstest kræve en sensitivitet på 75 % og en specificitet på ca. 99,7 % for at opnå den minimalt tolerable positive prædiktive værdi på 10 % for påvisning af OC i alle stadier. Ingen enkelt markør har hidtil nået denne målestok, og selv de bedste multimarkørpaneler har kun været i stand til at nærme sig denne grænse. Det kan være rimeligt at anvende et mindre end optimalt specifikt biomarkørpanel i definerede højrisikogrupper for at øge den positive prædiktive værdi. Ved at koble en suboptimal markør til teknikker som f.eks. transvaginal sonografi, der ganske vist er mere invasiv og dyrere, bør den samlede positive prædiktive værdi øges.