Fluorescerende antistofteknikker

Af Benedette Cuffari, M.Sc.Reviewet af Emily Henderson, B.Sc.

Siden dens oprindelige opdagelse i 1942 er immunofluorescensfarvning fortsat en meget pålidelig og effektiv teknik til en lang række forsknings- og diagnostiske formål.

Leukæmiceller mærket med fluorescerende molekyler. Image Credit: Vshivkova/.com

Generelt vil fluorescensantistofteknikker (FA) indebære brugen af celler eller et antistof, hvis konstante område er blevet mærket med en fluorescerende mærkning, også kendt som en fluorofor. FA-teknikker kategoriseres ofte som enten direkte eller indirekte.

Direkte fluorescensantistof

Den direkte fluorescensantistofteknik, som også kan kaldes direkte immunofluorescens (DIF), indebærer brug af et enkelt fluorescensmærket primært antistof, der bruges til at binde til et målantigen. Når DIF anvendes klinisk, er den især nyttig til hurtig diagnosticering af bakterielle sygdomme som Streptococcus pyogenes, der er mere almindeligt kendt som streptokokker, samt lungebetændelse, der skyldes enten Mycoplasma pneumoniae og Legionella pneumophilia-arter.

Til sådanne diagnostiske formål anbringes patientprøven først på et objektglas og eksponeres derefter for det fluorescerende antistof. Enhver binding mellem det fluorescerende antistof og målantigenet, som i disse situationer vil være bakterier, vil medføre, at disse stoffer lyser op ved undersøgelse med et fluorescensmikroskop.

Ud over sin anvendelse som diagnostisk værktøj anvendes DIF også i vid udstrækning til videnskabelige forskningsundersøgelser. Til sådanne formål anbringes en frossen vævsprøve, der er skåret i 5 eller 6 mikrometer (µm) tynde snit, på et objektglas.

Overfladen inkuberes derefter med et fluorescerende mærket antistof, som typisk vil omfatte et panel af antistoffer, der er rettet mod IgA-, IgG- og IgM-antistofisotyper sammen med komplement 3, der er rettet mod det pågældende antigen.

Bemærk, at koncentrationen af det antistof, der anvendes til denne type undersøgelse, vil være baseret på tidligere eksperimenter, der har bekræftet, hvilken koncentration der kan opnå det højeste signal/baggrund-forhold.

Når objektglassene er blevet inkuberet i mindst 30 minutter i mørke og ved stuetemperatur, vaskes objektglassene, hvorefter de afbildes med et fluorescensmikroskop.

Image Credit: anyaivanova/.com

Indirekte fluorescensantistof

I forhold til den teknik i ét trin, der anvendes til DIF, er indirekte IF (IIF) eller indirekte FA (IFA) en proces i to trin, der begynder med påføring af et umarkeret primært antistof på prøven, som er rettet mod et målantigen. Det andet trin i IIF indebærer anvendelse af et fluorescensmærket sekundært antistof, der er rettet mod Fc-delen af det primære antistof.

Men selv om IIF anses for at være mere kompliceret end DIF, da det tager længere tid at gennemføre og kræver anvendelse af to kompatible antistoffer, er den overlegen med hensyn til dens følsomhedsegenskaber.

Nogle almindelige kliniske anvendelser af IFA-tests omfatter dem, der anvendes til diagnosticering af syfilis. Ved denne type IFA-test isoleres T. palladium-celler, der tidligere er isoleret fra et forskningsdyr, og placeres på overfladen af et objektglas. Et serum, der er erhvervet fra en patient, spredes derefter ud over T. palladium-cellerne, så antitreponemale antistoffer, hvis de er til stede, kan binde sig til de fikserede antigener.

Når patientens serumprøve er vasket væk, tilsættes et sekundært antistof, der er blevet mærket med en fluorofor. Et positivt syfilisresultat vil belyse alle sekundære antistof-fluorophore-konjugatkomplekser.

En anden type IFA, der er meget anvendt i kliniske sammenhænge, er den, der anvendes til diagnosticering af systemisk lupus erythematosus (SLE). Patienter med SLE, som er en autoimmun sygdom, vil have et forhøjet niveau af cirkulerende anti-nucleære autoantistoffer (ANA), som er rettet mod både DNA og forskellige proteiner, der binder til DNA.

Til denne type IFA-test dyrkes celler og placeres derefter på et objektglas. Hvert objektglas inkuberes derefter med en anden koncentration af patientens antistof, som derefter vaskes for at fjerne eventuelle ubundne proteiner.

Efter vasketrinnet tilsættes et fluorescerende mærket sekundært antistof, som for ANA-testen vil være antihuman IgG, til objektglassene og får lov til at inkubere. En titer af ANA i serumet fås derefter fra den højeste serumfortynding, der viste fluorescens, og bruges til at bestemme en SLE-diagnose.

Flowcytometri

Den tredje type fluorescerende antistofteknik omfatter flowcytometri, som er et automatiseret celletællingssystem, der kan bruges til at kvantificere specifikke celler, der er til stede i komplekse blandinger som f.eks. blod eller serum.

Et typisk flowcytometriforsøg begynder med inkubation af et fluorescerende mærket antistof, der er målrettet mod en specifik subpopulation af celler, f.eks. anti-CD4, som kan binde sig til glykoproteinet CD4, der findes på overfladen af forskellige immunceller, herunder T-hjælperceller, monocytter og makrofager. Flowcytometri kan også kvantificere tilstedeværelsen af flere celletyper ved brug af passende cellemagere.

Når inkubationen er afsluttet, føres prøven derefter ind i flowcytometeret. I denne maskine tvinger en smal kapillær de celler, der er til stede i prøven, til at bevæge sig igennem i en enkelt fil. Mens cellerne bevæger sig gennem kapillæret, bruges en laser til at aktivere og excitere alle celler, der er blevet mærket med fluoroforen.

Fluorescensintensiteten af hver exciteret celle måles derefter af både fremadrettede og sidedistancedetektorer og afbildes på et histogram til analyse. Ud over kvantificeringsformål kan både flowcytometri og immunofluorescens anvendes til at sortere celler i rensede subpopulationer til forskningsformål ved hjælp af en teknik, der er kendt som fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Immunofluorescensteknikker. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Kapitel 20.5 Fluorescerende antistofteknikker. In: Microbiology. Tilgået fra https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). Immunofluorescensteknikkerne i forbindelse med diagnosticering af endokrine autoimmune sygdomme. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

Videre læsning

• Alle antistoffer Indhold
• VHHH-antistoffer (Nanobodies) Fordele og begrænsninger
• Antistofudvælgelse ved hjælp af DNA Origami Scaffolds
• Anvendelser af Histone Deacetylase (HDAC)-antistoffer i Forskning
• Anvendelse af antistoffer til forskning i Parkinsons sygdom

Skrevet af

Benedette Cuffari

Efter at have afsluttet sin bachelor of Science i toksikologi med to underfag i spansk og kemi i 2016, fortsatte Benedette sine studier for at afslutte sin Master of Science i toksikologi i maj 2018. Under sin kandidatuddannelse undersøgte Benedette dermatotoksiciteten af mechlorethamin og bendamustin; to alkylerende nitrogen-sennep-alkyleringsmidler, der anvendes i kræftbehandling.

Citationer