INDLEDNING
Ibuprofen tilhører gruppen af ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler (NSAID), der anvendes til behandling af forskellige inflammatoriske processer, smerter eller feber. Den mekanisme, der ligger til grund for virkningerne af ibuprofen, stammer fra inhiberingen af cyclooxygenase (COX)-aktiviteten, som er nødvendig for prostaglandinsyntesen (PG).1 PG produceres fra arachidonsyre, der stammer fra plasmamembranen, og lokal PG-produktion har hormonlignende virkninger. To COX-isoformer udtrykkes i humane væv: den konstitutivt udtrykte COX-1 isoform findes i de fleste væv, mens COX-2 isoformen er stærkt induceret under inflammatorisk respons, herunder patologiske tilstande med kronisk inflammation og tyktarmskræft2 . Blandt de forskellige COX-2-afledte produkter findes de højeste PGE2-niveauer i tumorer og påvirker forskellige processer, herunder celleproliferation og apoptose.3 I normal fysiologi spiller PGE2 en rolle i vedligeholdelsen af den gastrointestinale slimhinde, der regulerer processer som f.eks. slimsekretion og udvidelse af blodkar.4 Længerevarende NSAID-behandling kan således medføre bivirkninger, herunder tarmblødning. De fleste NSAID, herunder ibuprofen, hæmmer begge COX-isoformer.
Profylaktisk brug af NSAID er dokumenteret at reducere risikoen for at dø af kolorektal cancer.5-9 F.eks. viste en daglig dosis aspirin på 300 mg over en periode på 10 år en statistisk signifikant beskyttende effekt.7,10,11 En lignende risikoreduktion blev rapporteret med en daglig ibuprofendosis på 200 mg ibuprofen8,11-19 for forskellige tumortyper: 51 % reduktion af risikoen for tyktarmskræft, 72 % for brystkræft, 62 % for prostatakræft og 59 % for lungekræft.19
Hvordan forebygger IBUPROFEN KRÆFT?
Akkumulerende beviser har afsløret, at inflammation fremmer tumorigenese,20,21 især når vævet er under kroniske inflammatoriske forhold. Inden for tumormikromiljøet udveksler inflammatoriske celler signaler med tumorceller. Strømceller udskiller overlevelsesfaktorer til tumorcellerne, mens tumorcellerne producerer cytokiner, som udløser stromcellernes proteolytiske remodellering af den ekstracellulære matrix eller dannelsen af nye blodkar.20,22 Ibuprofen hæmmer COX-aktiviteten og den efterfølgende dannelse af proinflammatorisk PG; denne virkning menes at ligge til grund for ibuprofens kemopræventive virkning. PGE2 aktiverer f.eks. G-protein-koblede PGE2-receptorer, der stimulerer forskellige signalveje, der er involveret i celleproliferation og overlevelse.23,24
I denne artikel gennemgår forfatterne yderligere virkningsmekanismer, der er uafhængige af COX-2-hæmning, med henblik på at øge bevidstheden om, at de kliniske virkninger af ibuprofen kan formidles af flere cellulære processer. Den præsenterede dokumentation blev hentet fra søgemaskinen PubMed med “ibuprofen AND cancer” som søgeord. Undersøgelser, der rapporterede COX-uafhængige virkninger, herunder de undersøgelser, der blev udført i forfatternes laboratorium, blev udvalgt til gennemgang.
ADDERLIGE Mekanismer, SOM IBUPROFEN INHIBITERER TUMORCELLER
I 2015 gennemgik Matos og Jordan25 behandlingen af kræftceller med ibuprofen. HCT-116-kolorektalceller udtrykker ikke COX-2, men behandling med 2 mMol/L ibuprofen gav proapoptotiske virkninger.26 Ibuprofen i en lav koncentration på 100 µMol blev yderligere identificeret som en direkte og COX-uafhængig ligand af peroxisome proliferator-aktiveret receptor gamma (PPARγ)27 og blev vist at stimulere dens nukleare aktivitet i rottemodeller for dannelse af tarmkræft.28 Den proapoptotiske virkning, der er observeret for ibuprofen, kan således til dels skyldes PPARγ-aktivering, som fører til nedregulering af den antiapoptotiske transkriptionsfaktor NFκB.28
Et andet COX-uafhængigt cellulært respons efter ibuprofenbehandling blev rapporteret at involvere P75NTR, et medlem af TNF-receptorsuperfamilien. Behandling af kræftceller med 1 mMol/L ibuprofen resulterede i en p38 mitogenaktiveret proteinkinase-afhængig stabilisering af p75NTR mRNA-stabilitet, hvilket førte til øgede ekspressionsniveauer29 og induktion af apoptose og vækstundertrykkelse.30
En lignende apoptosefremmende virkning blev rapporteret i HCT116-celler, da ibuprofenbehandling (1,5 mM i 24 timer) viste sig at sensibilisere disse celler over for den TNF-relaterede apoptoseinducerende ligand.31 Den underliggende mekanisme involverede ekspression af membranreceptoren for TNF-relateret apoptoseinducerende ligand: dødsreceptor 5, et andet medlem af TNF-receptorsuperfamilien.
Ibuprofenbehandling (1 mMol/L i 24 timer) blev endvidere rapporteret at reducere de nukleare niveauer af β-catenin signifikant i SW480- og DLD-1-kolortumorceller. Tilsvarende blev ekspressionen af et af dets transkriptionelle mål, det pro-proliferative cyklin D1-gen, undertrykt.32 Selv om den underliggende mekanisme endnu ikke er fastlagt, synes denne virkning af ibuprofen at være af særlig interesse for forebyggelse af kolorektal cancer, fordi overdreven β-catenin-signalering kan forårsage uhensigtsmæssig vækststimulering af stamceller fra tyktarmsslimhinden.33
Sammen med virkningen på β-catenin-signalering interfererede ibuprofen også direkte med NFκB-vejen. En hurtig virkning af ibuprofenbehandling, der er observeret i cellerne, er den hæmmende fosforylering af GSK-3β på serin 9.32 Denne modifikation viste sig at regulere NFκB-signalering negativt, på et trin nedstrøms for nedbrydningen af dets inhibitorprotein IkBα, og at undertrykke ekspressionen af anti-apoptotiske NFκB-målgener, såsom BCL2 og BIRC5.
Andre eksempler på COX-uafhængige virkninger af 100 µMol ibuprofen omfatter hæmning af integrinekspression i neutrofile34 eller caspase-medieret frigivelse af proinflammatoriske cytokiner i HCT-116- og HeLa-celler35 .
IBUPROFEN, ALTERNATIE SPLICING OG KANCER
Kræftceller adskiller sig i deres genekspressionsprogram fra deres tilsvarende differentierede normale celler. Ud over transkriptionel regulering ved genpromotorer har de seneste 15 år klart vist, at alternativ splejsning fungerer som en vigtig mekanisme til regulering af genekspression. For eksempel genererer alternativ splejsning transkriptvarianter, som enten kan være ikke-funktionelle og hurtigt nedbrydes eller oversættes til proteinisoformer med forskellige, undertiden antagonistiske, funktionelle egenskaber på grund af forskellig brug af funktionelle proteindomæner36,37 .
For nylig blev hæmning af den alternative splejsningvariant RAC1b identificeret som en anden COX-uafhængig virkning af ibuprofen.38 Coloninflammation blev vist som en udløsende faktor for øget ekspression af det tumorrelaterede RAC1b-protein, en splejsningvariant af den lille GTPase RAC1. RAC1b-proteinet indeholder et ekstra domæne, der er kodet af et 57 basepar langt alternativt exon (exon 3b), som giver øget proteinaktivering og skaber en hyperaktiv variant, der er i stand til at stimulere NFκB-signalering39-42 . Når kolorektalceller blev behandlet med ibuprofen, men ikke med aspirin eller flurbiprofen, blev både mRNA- og proteinniveauerne af RAC1b markant reduceret in vitro og in vivo.38 Mens mange undersøgelser af virkningen af NSAID på tumorcellers levedygtighed anvendte koncentrationer på op til 2 mMol/L,43 blev effekten af ibuprofen på alternativ splejsning af RAC1b observeret ved lave doser på 100 µMol. Interessant nok hæmmede ibuprofen RAC1b-positive HT29-kolorektalceller mere end normale kolonocytter og påvirkede også deres vækst som subkutane xenografts af tumorer i mus. Den hæmmende virkning af ibuprofen kunne reddes, når en splejsning-uafhængig RAC1b cDNA-sekvens blev udtrykt i HT29-cellen38 . Dette tyder på, at ibuprofen virker direkte på den alternative splejsning.
En anden rapport om modulering af alternativ splejsning blev opnået, da prostatakræftceller modtog kombineret behandling af ibuprofen og epigallocatechin-3-gallat (EGCG), en grøn te-komponent med antikarcinogene egenskaber, der fremmer G0/G1-cellecyklusstop og apoptose. I dette tilfælde blev balancen mellem anti og proapoptotiske splejsningvarianter af BCL-X og MCL-1 forskudt i retning af de kortere og proapoptotiske BCL-X(S)- eller MCL-1(S)-varianter.44 Selv om mekanismen ikke blev fuldt identificeret, involverer den aktivering af proteinfosfatase PP1, som er kendt for at defosforylerer regulerende proteiner, der er involveret i pre-mRNA-splejsning.
Mekanismen for SPLICING MODULATION AF IBUPROFEN
Når protein-kodende gener udtrykkes i menneskelige celler, genererer RNA-polymerase 2 et primært transkript, pre-mRNA, som indeholder kodende exoner, der er adskilt af introniske sekvenser. Mens transkriptionen er i gang, genkendes konserverede nukleotidsekvenser omkring hvert exon-intron-knudepunkt af spliceosomet, et makromolekylært maskineri, der omfatter fem små nukleare ribonukleoproteinpartikler (U1, U2, U4, U5 og U6 små nukleare ribonukleoproteiner),45,46 som derefter fjerner introner under mRNA-splejsningsprocessen. Spliceosomets funktion understøttes af splejsningsforstærker- eller silencer-elementer, korte sekvenser, der findes i exoner eller introner, og som enten fremmer eller hæmmer spliceosomets produktive genkendelse af et givet exon. Splejsningsfaktorer genkender disse splejsningsforstærker- eller silencer-elementer, som for det meste tilhører den serin- og argininrige proteinfamilie eller de heterogene nukleare ribonukleoproteiner. De virker ofte antagonistisk, således at modulering af bindingen giver en mekanisme, der gør det muligt at inkludere eller springe et alternativt exon over og dermed at generere alternative transskriptioner. Alt i alt fungerer det sæt af splejningsfaktorer, der udtrykkes i en given celle, og deres relative ekspressionsniveauer i cellekernen på en kombinatorisk måde til regulering af alternativ splejsning.
For RAC1b reguleres den alternative splejsning af et enhancer-element i exon 3b, som genkendes af splejsningfaktoren SRSF1, og et tilstødende silencer-element, som genkendes af SRSF3.47
I humane kolorektalceller er tilgængeligheden af SRSF1 i kernen den vigtigste faktor, der regulerer inklusion eller skipping af exon 3b.48
En mekanisme, hvorigennem ibuprofen påvirker alternativ splejsning i celler, er fosforyleringsstatus for SRSF1. Cellefraktionerings- og immunoblot-eksperimenter viste, at ibuprofenbehandling forårsagede en reduktion i SRSF1-fosforylering (upublicerede data). Derimod havde aspirinbehandling ingen sådan virkning på SRSF1. Dette viste, at den hæmmende virkning af ibuprofen på RAC1b-splejsning involverede posttranslationel regulering af SRSF1’s subcellulære lokalisering.48
Den vigtigste proteinkinase, der er ansvarlig for SRSF1-fosforylering, er SRPK1, som findes både i cytoplasmaet og i cellekernen.49,50 Denne proces styres til dels af vækstfaktorreceptorsignalering.51 Som vist og beskrevet i figur 1 observerede forfatterne, at ibuprofenbehandling inducerede translokation af SRPK1 fra kernen til cytoplasmaet, og dette korrelerede med reducerede niveauer af SRSF1-fosforylering og RAC1b-protein, som detekteret i hele cellelysater ved western blot. Der blev ikke observeret nogen sådan effekt, når cellerne blev behandlet med aspirin under de samme betingelser, hvilket understreger ibuprofens COX-uafhængige virkning og specificiteten af dens virkning på splejsningfaktormodulationen.