1. Beskriv typerne af kemiske bindinger og kræfter i DNA-dobbeltspiralen.
DNA-dobbeltspiralen har to typer bindinger, kovalente bindinger og hydrogenbindinger. Kovalente bindinger findes inden for hver lineær streng og binder stærkt baser, sukkerstoffer og fosfatgrupper (både inden for hver komponent og mellem komponenterne). Hydrogenbindinger findes mellem de to strenge og dannes mellem en base fra den ene streng og en base fra den anden streng i komplementær parring. Disse hydrogenbindinger er individuelt svage, men samlet set ret stærke.
2. Forklar, hvad der menes med udtrykkene konservativ og semikonservativ replikation.
3. Hvad forstås ved en primer, og hvorfor er primere nødvendige for DNA-replikation?
En primer er et kort segment af RNA, der syntetiseres af primase ved hjælp af DNA’et som skabelon under DNA-replikation. Efter at primeren er blevet syntetiseret, tilføjer DNA-polymerase derefter DNA til 3′-enden af RNA’et. Primere er nødvendige, fordi den vigtigste DNA-polymerase, der katalyserer DNA-replikationen, ikke er i stand til at indlede DNA-syntesen og i stedet har brug for en 3′-ende. RNA’et fjernes efterfølgende og erstattes med DNA, således at der ikke er nogen huller i det endelige produkt.
4. Hvad er helicaser og topoisomeraser?
5. Hvorfor er DNA-syntesen kontinuerlig på den ene streng og diskontinuerlig på den modsatte streng?
Da DNA-polymerasen kun er i stand til at tilføje nye nukleotider i 3′-enden af en DNA-streng, og da de to strenge er antiparallelle, skal mindst to molekyler DNA-polymerase deltage i replikationen af et bestemt område af DNA. Når et område bliver enkeltstrenget, har de to strenge en modsat orientering. Forestil dig et enkeltstrenget område, der går fra venstre til højre. I venstre ende peger 3′-enden af den ene streng mod højre, og syntesen kan påbegyndes og fortsætte mod højre ende af dette område. Den anden streng har en 5′-ende, der peger mod højre, og syntesen kan ikke påbegyndes og fortsætte mod højre ende af den enkeltstrengede region i 5′-enden. I stedet skal syntesen påbegyndes et sted til højre for den venstre ende af det enkeltstrengede område og bevæge sig mod den venstre ende af området. Efterhånden som den første streng fortsætter syntesen (kontinuerlig syntese), strækker den enkeltstrengede region sig mod højre. Dette efterlader nu den anden streng urepliceret i dette nye enkeltstrengede område, og der skal ske en anden igangsættelse af DNA-syntesen, som bevæger sig fra den nuværende højre ende af det enkeltstrengede område hen imod det første igangsætningspunkt på denne streng. Dette resulterer i en diskontinuerlig syntese langs denne streng.
6. Hvis thymin udgør 15 procent af baserne i et bestemt DNA-molekyle, hvor stor en procentdel af baserne er så cytosin?
7. Hvis GC-indholdet i et DNA-molekyle er 48 procent, hvor stor er så procentdelen af de fire baser (A, T, G og C) i dette molekyle?
Frekvensen af både A og T er (52%) = 26%.
8. E. coli-kromosomer, hvor hvert kvælstofatom er mærket (dvs. hvert kvælstofatom er den tunge isotop 15N i stedet for den normale isotop 14N), får lov til at replikere i et miljø, hvor alt kvælstof er 14N. Ved hjælp af en gennemgående linje for en tung polynukleotidkæde og en stiplet linje for en let kæde skitseres følgende:
a.
Det tunge forældrekromosom og produkterne fra den første replikation efter overførsel til et 14N-medium, idet det antages, at kromosomet er en DNA-dobbeltspiral, og at replikationen er semikonserverende.
b.
Gentag del a, men antag, at replikationen er konservativ.
c.
Gentag del a, men antag, at kromosomet i virkeligheden består af to sideordnede dobbeltspiraler, som hver især replikerer semikonservativt.
d.
Gentag del c, men antag, at hver enkelt side-by-side dobbeltspiral replikerer konservativt, og at den samlede kromosomreplikation er semikonservativ.
e.
Gentag del d, men antag, at den samlede kromosomreplikation erkonservativ.
f.
Hvis datterkromosomerne fra den første deling i 14N spindes i en tæthedsgradient af cæsiumklorid (CsCl), og der opnås et enkelt bånd, hvilken af mulighederne i del a til e kan så udelukkes?Genovervej Meselson-Stahl-eksperimentet: hvad viser det?
9. R. Okazaki fandt, at de umiddelbare produkter af DNA-replikation i E.coli omfatter enkeltstrengede DNA-fragmenter med en længde på ca. 1000 nukleotider, efter at det nysyntetiserede DNA er blevet ekstraheret og denatureret (smeltet). Da han lod DNA-replikationen fortsætte i længere tid, fandt han en lavere frekvens af disse korte fragmenter og lange enkeltstrengede DNA-kæder efter ekstraktion og denaturering. Forklar, hvordan dette resultat kan hænge sammen med det faktum, at alle kendte DNA-polymeraser kun syntetisererDNA i 5′ → 3′-retningen.
Resultaterne tyder på, at DNA’et replikeres i korte segmenter, der efterfølgende forbindes ved enzymatisk indgriben (DNA-ligase). Fordi DNA-replikation er bidirektionel, fordi der er flere punkter langs DNA’et, hvor replikationen påbegyndes, og fordi DNA-polymeraser kun arbejder i 5′ → 3′-retningen, er en af DNA-strengene altid i den forkerte retning for enzymet. Dette kræver syntese i fragmenter.
10. Når plante- og dyreceller får tildelt impulser af thymidin på forskellige tidspunkter i løbet af cellecyklussen, viser det sig altid, at heterokromatiske områder på kromosomerne er “sent replikerende”. Kan du give et bud på, hvilken biologisk betydning denne observation kan have, hvis den overhovedet har nogen?
11. På planeten Rama består DNA’et af seks nukleotidtyper: A, B, C, D, E og F. A og B kaldes marziner, C og D erorsiner, og E og F er piriner. Følgende regler gælder for alle Ramas DNA’er:
a.
Oprettér en model for Ramas DNA’s struktur.
b.
På Rama producerer mitose tre datterceller. Med denne kendsgerning in mente foreslår du et replikationsmønster for din DNA-model.
c.
Opmærksom på meioseprocessen på Rama. Hvilke kommentarer eller konklusioner kan du foreslå?
12. Hvis du uddrager DNA’et fra coliphagen øX174, vil du opdage, at dets sammensætning er 25 procent A, 33 procent T, 24 procent G og 18 procent C. Giver denne sammensætning mening i forhold til Chargaffs regler? Hvordan vil du fortolke dette resultat? Hvordan kan en sådan fage replikere sit DNA?
Chargaffs regler er, at A = T og G = C. Da denne sammensætning ikke er observeret, er den mest sandsynlige fortolkning, at DNA’et er enkeltstrenget. Fagen ville først være nødt til at syntetisere en komplementær streng, før den kunne begynde at lave flere kopier af sig selv.
13. Den temperatur, ved hvilken en DNA-prøve denatureres, kan bruges til at vurdere, hvor stor en del af dens nukleotidpar der er G-C. Hvad ville grundlaget for denne bestemmelse være, og hvad ville en høj denatureringstemperatur for en DNA-prøve indikere?
Husk, at der er to hydrogenbindinger mellem A og T, mens der er tre hydrogenbindinger mellem G og C. Denaturering kræver, at disse bindinger brydes, hvilket kræver energi. Jo flere bindinger, der skal brydes, jo mere energi skal der tilføres. Den temperatur, ved hvilken et givet DNA-molekyle denatureres, er således en funktion af dets basesammensætning. Jo højere denatureringstemperaturen er, jo højere er procentdelen af G-C-par.
14. Lad os antage, at du uddrager DNA fra en lille virus, denaturerer det og lader det reannealisere med DNA fra andre stammer, der bærer enten en deletion, en inversion eller en duplikation. Hvad ville du forvente at se ved inspektion med et elektronmikroskop?
15. DNA, der er udvundet fra et pattedyr, denatureres ved varme og afkøles derefter langsomt for at muliggøre en reannealing. Følgende graf viser de opnåede resultater. Der er to “skuldre” i kurven. Den første skulder angiver tilstedeværelsen af en del af DNA’et, der annealerer meget hurtigt – faktisk så hurtigt, at annealingen sker, før der finder interaktioner mellem strengene sted.
a.
Hvad kan denne del af DNA’et være?
b.
Den anden skulder er også en del, der annealerer hurtigt igen. Hvad tyder dette bevis på?
16. Udform forsøg til bestemmelse af den fysiske sammenhæng mellem stærkt gentagne og unikke DNA-sekvenser i kromosomer. (Hint: Det er muligt at variere størrelsen af DNA-molekyler ved hjælp af den mængde skæring, som de udsættes for.)
17. Virus er kendt for at forårsage kræft hos mus. Du har et rent præparat af virusDNA, et rent præparat af DNA fra kromosomer fra musekræftceller og rent DNA fra kromosomer fra normale museceller. Virus-DNA vil specifikt binde sig med DNA fra kræftceller, men ikke med DNA fra normale celler. Undersøg den mulige genetiske betydning af denne observation, dens betydning på molekylært niveau og dens medicinske betydning.
18. Ruth Kavenaugh og Bruno Zimm har udviklet en teknik til at måle den maksimale længde af de længste DNA-molekyler i opløsning. De undersøgte DNA-prøver fra de tre Drosophila-karyotyper, der er vist til højre. De fandt, at de længste molekyler i karyotype a og b var af samme længde og ca. dobbelt så lange som det længste molekyle i karyotype c. Fortolk disse resultater.
Dataene tyder på, at hvert kromosom er sammensat af ét sammenhængende DNA-molekyle, og at translokationer kan ændre deres størrelse. I del c ser det ud til, at en del af det længste kromosom er blevet transloceret til det korteste kromosom.
19. Ved harlekin-kromosomteknikken tillader man tre omgange af replikation i bromodeoxyuridin og farvelægger derefter kromosomerne. Hvilket resultat forventer du?
