Stammar av Streptococcus pyogenes från Svåra invasiva infektioner binder HEp2- och HaCaT-celler mer än stammar från okomplicerade infektioner

Streptococcus pyogenes (streptokocker av grupp A ) är ett etiologiskt agens för olika sjukdomar hos människor, inklusive faryngit, pyodermi och allvarliga invasiva sjukdomar. Dessutom är patogenen förknippad med potentiellt livshotande följdsjukdomar som poststreptokockglomerulonefrit och akut reumatisk feber. I Northern Territory (NT) i Australien är incidensen av akut reumatisk feber mycket hög bland ursprungsbefolkningen (3), trots en låg isolering av GAS i halsen. Dessutom är pyodermi till följd av GAS-infektion extremt vanligt och poststreptokockglomerulonefrit är endemisk i många avlägset belägna aboriginska samhällen (4, 7). Medan asymtomatisk halsinfektion ofta är den rapporterade reservoaren för stammar som förknippas med invasiv sjukdom (5), är huden den primära reservoaren i befolkningar där impetigo är endemisk, såsom i aboriginska samhällen i de nordöstra delarna av landet. Oavsett vilken vävnad som är den primära infektionsstället är den första händelsen som patogenen måste uppnå är vidhäftning till värdceller. S. pyogenes-genomet kodar för många gener som kan betraktas som kodande för adhesiner. Dessa gener är starkt reglerade och enskilda stammar har inte den genetiska potentialen att koda för alla dessa proteiner. Till adhesinerna hör M-protein (en antifagocytisk molekyl), kapsel- och fibronectinbindande proteiner. Det finns många olika fibronectinbindande proteiner, till exempel SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2) och SfbII (11). Adherenskapaciteten hos en enskild stam kan variera beroende på den repertoar av gener för adhesiner som stammen har och deras uttrycksnivå. Detta kan i sin tur återspegla skillnaderna i förmågan att kolonisera och ihållande infektera olika vävnadsställen. En följd av detta är att isolat från olika vävnadsplatser kan uppvisa skillnader i adherenskapacitet. För att testa detta har vi bestämt omfattningen av bindningen av GAS-isolat från hud, hals och blod till HEp2- och HaCaT-cellinjer, som representerar humana laryngealepitelceller respektive keratinocyter.

GAS-isolat från NT samlades in mellan 1990 och 2002. De 72 stammar som analyserades i denna studie isolerades från blod (n = 26), hud (n = 22) och hals (n = 24) (tabell 1). Blodisolaten kom från allvarlig sjukdom och de återstående stammarna kom från okomplicerade infektioner. Isolaten Vir-typades enligt tidigare beskrivning (6). Vir-typning inbegriper restriktionsfragmentlängdspolymorfism av mga-regulatorn, som omfattar genen för det mycket variabla M-proteinet. För att säkerställa att epidemiologiskt obesläktade stammar inkluderades, inkluderades ett representativt isolat från varje Vir-typ. Kulturerna odlades över natten vid 37 °C i en orbital skakare till stationär fas i Todd-Hewitt-buljong (Oxoid, Basingstoke, Storbritannien) kompletterad med 1 % jästextrakt. För att förbereda GAS-inokulumet för adherensanalyser centrifugerades odlingarna över natten och pelletsen tvättades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS; Life Technologies Gibco BRL, New York, New York, N.Y.) och resuspenderades i serum- och antibiotikafritt RPMI 1640-medium (Life Technologies) till en optisk densitet vid 600 nm på 0,05. Detta motsvarar ungefär 1 × 107 till 1,5 × 107 bakterier per ml.

Humana laryngealepitelceller (HEp2) hölls i RPMI 1640-medium som kompletterades med 10 % fetalt kalvserum (Life Technologies), 1 % Fungizone (Life Technologies), 20 μg vancomycin HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Australien) per ml och 100 μg streptomycinsulfat (Sigma, St. Louis, Mo.) per ml. Keratinocyter från mänsklig vuxen hud (HaCaT-celler) hölls i Dulbecco’s modifierade Eagle-medium (Life Technologies) kompletterat med 10 % värmeinaktiverat fetalt kalvserum. För adherensanalyser såddes ∼105 celler/ml på glaslock med en diameter på 12 mm i botten av 24-håls vävnadskulturplattor (Nunc, Roskilde, Danmark). Efter tillväxt över natten vid 37 °C i 5 % CO2-atmosfär tvättades cellerna med PBS (pH 7,4) och inokulerades med 500 μl av GAS-inokulumet. Efter 2 timmars inkubation vid 37 °C tvättades täckglasen fem gånger genom att tillsätta 1 ml PBS till varje brunn, och efter försiktig blandning avlägsnades tvättlösningen genom aspiration. Efter avlägsnande av de icke-adhärenta bakterierna fixerades värdcellerna och de adherenta bakterierna med 95 % metanol och lufttorkades. Efter värmefixering placerades täckglasen på objektglas och gramfärgades för visning under oljeimpregnering. I varje experiment analyserades celler i flera slumpmässiga fält, och fastsättning uttrycktes som det genomsnittliga antalet GAS-kedjor per cell. Alla analyser utfördes i två exemplar och den genomsnittliga bindningen bestämdes för varje stam. Alla statistiska analyser utfördes med programmet Stata Statistics/Data Analysis version 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). Data analyserades med t-test.

GAS-stammar fastnade på båda celltyperna, och graden av bindning varierade från stam till stam (tabell 1). Det fanns en god korrelation mellan oberoende experiment med 20 isolat som upprepades med två tidsintervall (data visas inte), vilket tyder på att bindningens aviditet är reproducerbar och stamspecifik. Sammantaget är GAS-bindningen till HaCaT-celler större än till HEp2-celler (P < 0,05). När uppgifterna i tabell 1 separerades på grundval av vävnadsplatsen för isolering, band i genomsnitt 270 kedjor av GAS-stammar från blod till 50 HaCaT-celler (fig. 1). Däremot band isolat från hud och hals i genomsnitt endast 169 och 178 kedjor per 50 HaCaT-celler. Dessa skillnader är statistiskt signifikanta (P = 0,0044 respektive 0,0063). Intressant nog är skillnaderna för HEp2-celler mindre uttalade och inte statistiskt signifikanta. När data omanalyserades på nytt baserat på invasiva respektive okomplicerade infektioner genom att kombinera data för hud- och halsisolat hittades dock signifikanta skillnader mellan de två kategorierna i båda cellinjerna (P = 0,0011 för HaCaT; P = 0,0238 för HEp2).

Förrare arbeten från detta laboratorium visade att många vanligt förekommande cirkulerande stammar av S. pyogenes kunde orsaka invasiv sjukdom med huden som den primära platsen för infektionen (1). Dessa observationer stämmer överens med de nuvarande fynden av högre aviditet hos NT GAS-stammarna för HaCaT-cellinjer än HEp2-cellinjer och blodisolat som kan binda i större antal än isolat från okomplicerade infektioner. Möjliga förklaringar till den höga adherensbenägenheten hos S. pyogenes blodisolat inkluderar både genotypiska och fenotypiska skillnader mellan isolat från invasiva och icke-invasiva sjukdomskällor. Ytterligare studier krävs för att definiera arten av denna bindningsaviditet och för att avgöra om den är konsekvent inom klonala populationer.