Material och metoder
Deltagare
Subjekten bestod av 83 barn med ADHD (75 % pojkar) och 72 barn med ADHD (51 % pojkar), i åldrarna 6-13 år. Inklusionskriterier för ADHD-gruppen var: (a) en klinisk diagnos av ADHD enligt DSM-IV-kriterierna, (b) bekräftelse av denna diagnos genom Diagnostic Interview Schedule for Children, fjärde upplagan, administrerad till föräldrarna (DISC-IV-P; ), c) betydande ADHD-symtom, vilket framgår av föräldrarnas betyg >90:e percentilen på minst en av ADHD-skalorna (skalorna för ouppmärksamhet och hyperaktivitet/impulsivitet) i Disruptive Behaviour Disorder Rating Scale (DBDRS; ), och d) utbredda ADHD-symtom, vilket framgår av lärarnas betyg >75:e percentilen på minst en av ADHD-skalorna i DBDRS. Att ha en komorbid diagnos (t.ex. ODD eller ASD) var inget uteslutningskriterium, inte heller behandling med stimulerande läkemedel. Barn med stimulerande medicinering (N = 50, 60 % av ADHD-gruppen) slutade med läkemedelsanvändning 24 timmar före testet, för att möjliggöra fullständig utvattning, och under deltagandet i vår studie. Inklusionskriterierna för TD-gruppen var följande: (a) avsaknad av en klinisk diagnos av någon utvecklings- eller beteendestörning (inklusive ADHD och ODD), och (b) poäng <90:e percentil på både föräldra- och lärarbedömda ADHD-skalor i DBDRS.
Material
Beteende.
Föräldrarna till de barn som var berättigade att ingå i ADHD-gruppen bedömdes med avsnittet om störande beteendestörning i DISC-IV-P. DISC-IV-P är en allmänt använd standardiserad diagnostisk intervju för bedömning av DSM-IV:s barnpsykiatriska störningar hos barn, med adekvata psykometriska egenskaper .
Föräldrar och lärare till barn i både ADHD- och TD-gruppen fyllde i DBDRS för att bedöma ADHD-symtom och symtom på ODD och CD. DBDRS innehåller fyra skalor som mäter symtom på ouppmärksamhet, hyperaktivitet/impulsivitet, ODD och CD på en 4-punkts Likertskala (från 0 till 3), där högre poäng indikerar värre symtom. Adekvata psykometriska egenskaper har rapporterats för DBDRS .
The Strengths and Weaknesses of ADHD-symptoms and Normal Behaviour rating scale (SWAN; ) fylldes i av föräldrar och lärare för att bedöma symptom på ADHD. Detta allmänt använda frågeformulär innehåller två underskalor; Inattention scale och Hyperactivity/Impulsivity scale, som var och en består av 9 punkter. Punkterna poängsätts på en 7-gradig Likertskala (från -3 till +3), där högre poäng indikerar värre symtom. Punkterna är baserade på DSM-IV-symtomen för ADHD, men återspeglar båda ändarna (starka och svaga) av det beteende som beskrivs i varje ADHD-symtom. Medelpoäng på båda underskalorna användes som beroende variabler. Adekvata psykometriska egenskaper har rapporterats för SWAN .
ASD-symptom bedömdes med hjälp av den 65 punkter långa Social Responsiveness Scale (SRS; ), som fylldes i av föräldrar och lärare. Punkterna i SRS är baserade på DSM-IV:s symtomområden för ASD, inklusive försämrat socialt samspel, kommunikativa brister och begränsade/stereotypa mönster av beteenden eller intressen. SRS använder en 4-punkts Likert-skala (från 0 till 3), och den summerade poängsumman på den totala SRS-skalan användes som beroende mått, där högre poäng indikerar värre symtom. SRS har adekvata psykometriska egenskaper .
Blodfläckar.
För att undersöka blodkoncentrationerna av tryptofan, tyrosin och fenylalanin användes en teknik med torkade blodfläckar. Att samla in blodfläckar är mindre invasivt för barn än att ta venösa blodprover och tekniken med torkade blodfläckar är tillräckligt robust och stabil för diagnostiska ändamål . Koncentrationerna av AAA i blodprov är starkt korrelerade med AAA-koncentrationerna i serum (rs varierar mellan 0,86 och 0,96) . En blodfläck från varje barn samlades in med hjälp av en engångslansett. Tre bloddroppar drogs på ett blodfärgningskort. En 5,5 mm stor stans av en torkad blodfläck blandades med 100 μl av en intern standardlösning (innehållande 29 μm L-fenylalanin-D5, 6 μm L-tyrosin-D4 och 5 μm L-tryptofan-D5) och 400 μl metanol i en gaskromatografiflaska (GC-flaska) och skakades i 15 minuter i ett ultraljudsbad. Supernatanten överfördes till en annan GC-flaska och avdunstades under kväve vid 30 °C. Därefter butylerades provet med 100 μl 5,5 % acetylklorid (i n-butanol) vid 60 °C i 15 minuter. Därefter avdunstades butanolskiktet under kväve (vid 30 °C) och resterna löstes i 500 μl acetonitril. Koncentrationerna av tryptofan, tyrosin och fenylalanin i blodprov bestämdes genom positiv elektrospray-vätskekromatografi-tandem-masspektrometri (LC-MS/MS) med hjälp av en API 3000 tredubbel fyrpolig masspektrometer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), kopplad till ett högpresterande vätskekromatografisystem (HPLC) (Perkin Elmer Series 200, Shelton, USA). Tre μl av provet injicerades på en symmetry C18-kolonn (3,9*150mm, 5μm; Waters, Milford, MA, USA) och eluerades med en flödeshastighet på 1 ml/min av 75 % acetonitril (innehållande 0,4 % myrsyra). Tryptofan, tyrosin och fenylalanin eluerades inom 1 minut och mättes med hjälp av övergångarna: massa-till-laddningsförhållande (m/z) 261,2→159,2 (tryptofan), m/z 238,2→136,2 (tyrosin) och m/z 222,2→120,2 (fenylalanin). Alla erhållna LC-MS/MS-data förvärvades och bearbetades med hjälp av programvaran Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Koncentrationerna av tryptofan, tyrosin och fenylalanin i blodprovet uttrycktes i μmole/L. LC-MS/MS:s tillförlitlighet bekräftades genom att undersöka inter-assay-variansen (5-10 %), intra-assay-variansen (8-10 %) och återvinningen (90-112 %).
Proteinintag via kosten.
Dagligt proteinintag bedömdes under tre dagar, med hjälp av en näringsdagbok som föräldrarna rapporterade. Standardiserade kostjournaler och instruktioner tillhandahölls. Föräldrarna instruerades att registrera alla konsumerade livsmedel och drycker i kostjournalen och att uttrycka de konsumerade mängderna så noggrant som möjligt. Mängden proteinintag (gram/dag) beräknades på grundval av en datoriserad version av den nederländska databasen över livsmedelssammansättning . Den nederländska databasen över livsmedelssammansättning innehåller över 2 000 livsmedelsprodukter med information om deras näringsmässiga sammansättning . Databasen används i stor utsträckning för vetenskapliga ändamål (t.ex.).
Urin.
För att undersöka AAA-koncentrationer i urinen samlade deltagarna in all urin som utsöndrades under 18 på varandra följande timmar (efter skoltid) i en behållare för urinsamling. Under urinsamlingen förvarades behållaren i ett kylskåp (<5°C). Ett prov på 10 ml skickades till ett laboratorium för analys, där provet förvarades vid -20 °C. En HPLC-teknik med fluorescensdetektion användes för analys av tryptofan i urin . Koncentrationerna av tyrosin och fenylalanin i urinen bestämdes med hjälp av en Biochrom aminosyraanalysator . Urinkoncentrationerna av tryptofan, tyrosin och fenylalanin uttrycktes i förhållande till den totala urinvolymen för att utesluta effekter av polyuri eller oliguri. HPLC-teknikens tillförlitlighet bekräftades genom att analysernas precision undersöktes, som var 2,25 % för tryptofan (relativ standardavvikelse) och 1,50 % för tyrosin och fenylalanin. Det finns höga korrelationer mellan aminosyrakoncentrationerna i 12-timmarsprov och 24-timmarsprov , vilket tyder på att det inte finns någon dygnsvariation i utsöndringen av aminosyror, vilket bekräftar användningen av ett 18-timmarsprov i den aktuella studien.
Förfarande
Denna studie har godkänts av den lokala medicinska etiska kommittén vid VU University Medical Center Amsterdam, Nederländerna (#NL39922.029.12), och har utförts i enlighet med de etiska normer som fastställs i Helsingforsdeklarationen från 1964 och dess senare ändringar. Skriftligt informerat samtycke inhämtades från föräldrarna till alla barn, och från barn ≥12 år, före deltagandet. Barn med ADHD rekryterades från öppenvårdskliniker för psykisk hälsa, via föräldraföreningen för barn med beteendeproblem och via en forskningswebbplats vid ett universitet. TD-gruppen rekryterades från grundskolor i hela landet. Barn som fick stimulerande medicinering slutade med läkemedelsanvändning en dag före deltagandet (dag 0), för att säkerställa fullständig utsköljning, och under bedömningen av blod-, urin- och matintag (dag 1 till dag 3). Dag 1 togs blodprovet tidigt på morgonen för att utesluta effekterna av dygnsvariationer av AAA-koncentrationer i blodet. Samma dag, efter skoltid, började man samla in urin och fortsatte under de följande 18 timmarna, tills barnet återvände till skolan nästa morgon (dag 2). Tidigt på morgonen dag 1 fick föräldrarna detaljerade instruktioner om hur de skulle fylla i kostjournalen och hur de skulle samla in urin från sitt barn. Efter instruktionen började föräldrarna registrera sitt barns kostintag, vilket fortsatte under de följande tre dagarna (dag 1 till dag 3). Föräldrar och lärare uppmanades att fylla i frågeformulären på en säker webbplats. Alla uppgifter samlades in mellan februari 2013 och juli 2014. ADHD- och TD-gruppen rekryterades samtidigt för att kontrollera eventuella säsongseffekter på matintag eller AAA-metabolism.
Dataanalys
Alla statistiska analyser utfördes med hjälp av R, version 3.2.1. Alla variabler inspekterades på outliers och saknade värden för ADHD- och TD-gruppen separat. Winsorising tillämpades på outliers, dessa ersattes med ett värde som var en enhet större (eller mindre) än det föregående mest extrema resultatet i fördelningen för gruppen . Saknade data i urinkoncentrationer, kostdata och beteendedata fördelades slumpmässigt och ersattes med hjälp av gruppens medelvärden. För blodproverna saknades inga uppgifter. Alla data var normalfördelade, med undantag för symtom på CD. Gruppskillnader i kön undersöktes med hjälp av ett chi-kvadrat-test, och gruppskillnader i ålder och beteendefunktion undersöktes med hjälp av t-test för oberoende urval.
För att testa den första hypotesen bedömdes gruppskillnader i AAA-blodpottkoncentrationer med hjälp av variansanalyser (ANOVA) med gruppen (ADHD eller TD) som fast faktor. Effektstorlekarna beräknades i termer av partiell eta kvadrat och tolkades som små (> .01), medelstora (>.06) eller stora (>.14) . Dessutom beräknades oddskvoter som uttryckte risken för att få diagnosen ADHD med koncentrationer under genomsnittet av AAA. Normativa data för AAA-koncentrationer hämtades från ett stort urval av 6-13-åriga barn (N = 104, 52 % män) (opublicerade data, information om urvalet och resultat tillgängliga från författarna). För varje AAA användes koncentrationer som motsvarar den lägsta 16:e percentilen (M-1 SD) i det normativa urvalet som ett tröskelvärde för att definiera AAA-koncentrationer under genomsnittet (för tryptofan 45 μmole/L, tyrosin 39 μmole/L och fenylalanin 47 μmole/L). Oddsförhållanden beräknades med deras 95-procentiga konfidensintervall och Fishers exakta test utfördes för att undersöka oddskvoternas signifikans.
För att testa den andra hypotesen undersöktes sambandet mellan AAA-koncentrationer i blodprov och både föräldrars och lärares bedömda symtom på ADHD med hjälp av Pearson-produkt-momentkorrelationskoefficienter. Storleken på korrelationskoefficienterna tolkades som liten (>.10), medelstor (>.30) eller stor (>.50) . Data från ADHD-gruppen och TD-gruppen kombinerades för att maximera variabiliteten i mätningarna av ADHD-symtom.
För att testa den tredje hypotesen utfördes korrelationsanalyser mellan AAA-koncentrationer i blodprov och proteinintag och AAA-koncentrationer i urin i hela provet. Vi undersökte också om det fanns gruppskillnader i proteinintag och AAA-koncentrationer i urin med hjälp av ANOVAs med grupp (ADHD eller TD) som fast faktor. Slutligen utvärderade vi genom korrelationsanalyser om AAA-koncentrationer i blodprov var relaterade till föräldrars och lärares rapporterade symtom på komorbida psykiatriska störningar (Pearson-produkt-momentkorrelationskoefficienter för ODD och ASD, Spearmans rangkorrelationskoefficienter för CD). Om symtom på ODD, CD eller ASD konstaterades vara relaterade till AAA-koncentrationerna gjordes tidigare analyser om med dessa symtom inlagda som kovarianter. För att korrigera för multipel testning justerades alfa-nivån för korrelationsanalyserna enligt Bonferroni-förfarandet per resultatområde; ADHD-symptom (12 analyser, alltså p = 0,004), potentiella bestämningsfaktorer för AAA-avvikelser i blodfläckar (12 analyser, alltså p = 0,004) och symtom på komorbida psykiatriska störningar (18 analyser, alltså p = 0,003). Bonferroni-justerade resultat rapporteras.