Kopieringsantalet av metylerat O6-metylguanin-DNA-metyltransferas (MGMT) bestäms i förhållande till kopian av beta-actin (ACTB) med hjälp av metyleringsspecifik polymeraskedjereaktion i realtid (MSP). För att göra detta berikas tumörvävnad genom manuell mikrodissektion följt av DNA-extraktion. DNA kvantifieras med hjälp av Picogreen och modifieras genom bisulfitbehandling som gör att ometylerade cytosiner omvandlas till uracyl medan metylerade cytosiner förblir oförändrade. Därefter utförs en metyleringsspecifik PCR (MSP) i realtid på Quantstudio 5-instrumentet för att kvantifiera antalet kopior av MGMT och ACTB (1). Denna teknik består i att utföra en PCR med realtidsdetektering med hjälp av amplifluor-detekteringssystemet. Prover med ett okänt antal kopior kan kvantifieras genom att jämföra deras Ct-värden med dem för en plasmidstandardkurva.
Klinisk implikation
MGMT är ett DNA-reparationsenzym som ofta inaktiveras genom hypermetylering i mänsklig cancer. När celler saknar MGMT-aktivitet repareras inte DNA-skador på rätt sätt, vilket gör en individ mer benägen att utveckla cancer. Intressant är att denna brist på MGMT-aktivitet också gör en tumörcell mer känslig för strålbehandling och vissa alkylerande läkemedel såsom temozolomid (2). I den internationella prognostiska fas III-valideringsstudien (RTOG 0525) identifierade MGMT-analysen framgångsrikt nydiagnostiserade glioblastompatienter som med större sannolikhet kommer att leva längre och ha en längre progressionsfri tidsperiod efter behandling med temozolomid (3-5). Nyligen publicerades en ny publikation där både metylerade och ”gråzonspatienter” presterade betydligt bättre när det gäller total överlevnad än verkligt ometylerade patienter (6).
Provtagningskrav
Acceptabla prover för analysen är formalinfixerade, paraffininbäddade gliomvävnadsprover med en fixeringstid på 6-48 timmar.
Volym
Ett representativt paraffinblock är att föredra. Alternativt accepteras 5 ofärgade vävnadssektioner (1 objektglas med 5 µm tjocklek för H&E-färgning och minst 4 objektglas med 5-10 µm tjocklek för MGMT-testning).
Instruktioner för förvaring och transport
Förvara och transportera proverna vid omgivningstemperatur.
Begränsningar
För vissa prover erhålls ett ogiltigt resultat på grund av ett otillräckligt antal ACTB-kopior i kombination med ett antal MGMT-kopior under detektionsgränsen. Oftast förklaras detta av otillräcklig DNA-kvantitet och/eller kvalitet. För ogiltiga prover med ett antal kopior för MGMT och/eller ACTB runt LOD/LOQ och gränsen rekommenderas att man gör ett nytt test med utgångspunkt från bisulfitbehandlat DNA. Andra fixeringsmedel än formalin eller förlängd fixeringstid kan ge upphov till otillräckliga resultat.
Speciella krav
Inga
Turn-Around Time
Fem till sju arbetsdagar för objektglas respektive paraffinblock.
- Vlassenbroeck I et al. Validering av metyleringsspecifik PCR i realtid för att bestämma metylering av O6-metylguanin-DNA-metyltransferas-genets promotormetylering i gliom. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-dense temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: a randomized phase III clinical trial.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomide versus standard 6 veckors strålbehandling versus hypofraktionerad strålbehandling i patienter äldre än 60 år med glioblastom: den nordiska randomiserade fas 3-studien. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomide chemotherapy alone versus radiotherapy alone for malignant astrocytoma in the elderly: the NOA-08 randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide. En poolad analys av fyra kliniska prövningar. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Uppdaterad den 23 maj 2019