Mekanism för synergistisk depolymerisering av spetsiga ändar av aktinfilament genom cyklasassocierat protein och cofilin

DNA-konstruktioner

Alla mus N-CAP-proteiner, N-CAP-GFP, CAP1 i full längd, HFD-domänen, GST-fusion av HFD-domänen och den C-terminala ADF-H-domänen av twinfilin, klonades in i bakterieexpressvektorn pSUMOck4 (en vänlig gåva från Inari Kursula, University of Bergen, Norge) för att uttrycka ett SUMO-märkt fusionsprotein som lämnar en nativ N-terminus efter klyvning med SENP2-proteas. För CARP-domänen och C-CAP-konstruktionerna använde vi pCoofy18 bakterieexpressionsvektor (en vänlig gåva från Addgene). För detaljer om proteinkonstruktionerna och primers som användes för kloning av konstruktionerna, se tilläggstabell 2.

Expression och rening av CAP-proteiner och dess fragment

Alla CAP-proteiner från musen och dess fragment, utom fullängds-CAP1, uttrycktes vid +22 °C i LB-autoinduktionsmedium (AIMLB0210, Formedium) under 24 timmar i BL21(DE3) E. coli (från Novagen).

Mus CAP1 i full längd uttrycktes i LB-medium i ArcticExpress (DE3) E. coli-celler. Först inokulerade vi en startkultur som innehöll kanamycin (20 µg/ml) och gentamycin (20 µg/ml) som inkuberades i 6 timmar vid +37 °C. Den 3,6 l stora huvudkulturen, som endast innehöll kanamycin (20 µg/ml), inokulerades och odlades till en OD600 på ~0,4 vid +37 °C och skakades vid 240 rpm. Odlingstemperaturen ändrades till +13 °C i 1 timme före proteinuttryck som inducerades genom tillsats av 0,26 mM IPTG i 46 timmar. Alla bakteriepellets samlades upp genom centrifugering, resuspenderades i 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5, snapinfrystes med flytande N2 och förvarades vid -80 °C.

Alla CAP-proteiner och twinfilinets ADF-H-domän renades med ett liknande arbetsflöde. Först lyserades bakterier genom sonikation i närvaro av lysozym (0,5 mg/ml), DNAse (0,1 mg/ml) och proteashämmare (200 µg/ml PMSF, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml aprotinin, 1 µg/ml pepstatin A; alla från Sigma-Aldrich), och lysatet klarades genom centrifugering. Supernatanten laddades i en 1 ml HisTrap HP Ni-NTA-kolonn (GE Healthcare) och tvättades flitigt (>20 kolonnvolymer) med 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5. Proteinet eluerades med 25-250 mM imidazolgradient på AKTA Pure-maskinen (GE Healthcare). Toppfraktioner sammanfördes och SENP2-proteas tillsattes till en slutkoncentration på 40 µg/ml för avlägsnande av SUMO-tagget. Blandningen dialyserades O/N vid 4 °C med hjälp av SnakeSkin dialysslangar i 1 l 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,4 buffert. Nästa dag avlägsnades de klyvda SUMO-taggarna med Ni-NTA agarospärlor (Qiagen) i de fall där SUMO-taggarna och det klyvda proteinet var lika stora. Proteinerna koncentrerades med Amicon Ultra-4 10 kDa centrifugalfilter (Merck) och laddades i HiLoad 16/600 Superdex 200 gelfiltreringskolonn (GE Healthcare) som balanserades i 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4. Toppfraktioner samlades upp, koncentrerades och frystes genom snabbfrysning i N2 för lagring vid -80 °C.

Den fullständiga CAP renades med följande undantag. Vi använde en 5 ml HisTrap HP Ni-NTA-kolonn i stället för 1 ml kolonn. Efter dialys och gelfiltrering med HiLoad 16/60 Superdex 200 gelfiltreringskolonn kördes de större toppfraktionerna genom Superose 6 increase 10/300 GL gelfiltreringskolonn för att få en bättre separation av blandningen av oligomeriska tillstånd. Slutligen kombinerades de största topparna från flera körningar, koncentrerades med 5 minuters spinintervall med Amicon Ultra-4 30 kDa centrifugalfilter och lagrades enligt ovan. CARP- och C-CAP-proteiner renades enligt ovan med undantag för användning av 3C-proteas (0,01 mg/ml) för taggklyvning.

Andra proteiner

Muskelaktin från kanin, märkta aktiner, profilin, cofilin-1 från mus, capping-protein och biotin-gelsolin framställdes enligt beskrivningen i ref. 16. ADP-actin framställdes enligt beskrivningen i ref. 34. Kortfattat: 30 µM ATP-G-actin-lösning innehållande 0,3 mM glukos och 1 enhet/ml hexokinas (Sigma) dialyserades mot nukleotidutbytesbuffert (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) under 4 timmar vid 4 °C. Alla experiment utfördes med α-actin från kaninmuskel.

Actin pointed end depolymerization assays

Mätning av aktinfilamentens depolymeriseringshastighet i de spetsiga ändarna utfördes med hjälp av en mikrofluidikanordning kopplad till en mikroskopiuppställning, enligt beskrivning16. I korthet förberedde vi en kammare med poly dimetylsiloxan (PDMS, Sylgard), som monterades på ett rengjort täckglas. De mikrofluidiska kamrarna var 20 µm höga. De tre inloppen och utloppet var anslutna till tryckstyrda rör fyllda med lösningar av olika biokemisk sammansättning (Fluigent mikrofluidikanordning).

Efter montering sköljdes kamrarna med dH20 och F-buffert (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT och 1 mM DABCO). Kammaren utsattes sedan successivt för: 150 µl av 0,1 % biotin-BSA i F-buffert, 300 µl av 5 % BSA, 150 µl av 3 µg/ml neutravidin i F-buffert och 10-100 µl av 1-3 pM biotin-gelsolin. Före experimenten polymeriserades aktinfilamenten (8 µM, >30 min) i F-buffert. En fraktion av aktinmonomerer märktes med Alexa-488 eller 568. Filamenten injicerades slutligen i kammaren och förankrades i täckglaset med gelsolinerna tills önskad densitet uppnås.

För att mäta depolymeriseringshastigheten hos cofilin-dekorerade spetsändar mättades filamenten först med 2 µM cofilin och exponerades för 2 µM cofilin kompletterat med olika CAP-proteiner. Depolymeriseringshastigheten analyserades med ImageJ, genom att först göra en kymograf för varje filament (funktion reslice) och manuellt anpassa en lutning längs den spetsiga änden. Filament, vars spetsiga ändar inte kunde spåras tydligt eller som hade möjliga (o)observerade pauser53 eller avskiljningshändelser, valdes bort från analysen.

För att minimera effekten av proteinmärkningen på våra mätningar använde vi antingen 10 % eller 16 % märkningsfraktion av aktin beroende på mikroskopiuppsättningen. Vi observerade inga effekter av märkningsfraktionen för N-CAP-aktivitet i våra experiment. Alla experiment utfördes vid rumstemperatur, i en icke temperaturkontrollerad uppställning.

Renovering av aktinfilament

Förberedda, stabila F-aktinlösningar (i F-buffert) med olika fluorescerande etiketter blandades och inkuberades för att kvantifiera renovering. Den blandade lösningen innehöll 4 µM Alexa568-actin (10 % märkt) och 4 µM Alexa488-actin (10 % märkt), med eller utan N-CAP och mutanter. Efter 4 minuter i rumstemperatur späddes den blandade F-actinlösningen 100× i buffert kompletterad med 0,2 % metylcellulosa och flödade in i en öppen kammare tillverkad med dubbelhäftande tejp mellan två täckglas och passiverad med BSA. Bildserier (2 s intervall) togs i minst tre olika synfält. Antalet gröna (Alexa488) F-actinsegment räknades, liksom antalet av dessa segment som var anslutna till ett rött (Alexa568) F-actinsegment, för att bestämma förhållandet mellan två färgsegment som visas i fig. 2f. Genom att övervaka spridningen av filamenten kunde vi entydigt avgöra när två segment var sammankopplade. Kontrollerna (utan N-CAP i F-actinblandningen) upprepades flera gånger och experimenten (med N-CAP eller mutanter) minst två gånger.

Actin severing assays

För att undersöka N-CAP:s inverkan på cofilinets severing använde vi två olika metoder, antingen (1) genom att mäta fraktionen av enskilda cofilin-domäner som ännu inte lett till en severing eller (2) genom att kvantifiera det globala antalet severing-händelser per µm aktinfilament.

(1) Severing associerad med enskilda cofilin-domäner (Supplementary Fig. 3c). Vi följde det förfarande som beskrivits tidigare16. Kortfattat, inne i en mikrofluidisk kammare polymeriserades 12 % Alexa-488-märkta aktinfilament från spectrin-aktinfrön, som förankrades ospecifikt på ett BSA-passiverat täckglas. Filamenten åldrades i 15 minuter med en lösning av G-actin vid kritisk koncentration (100 nM G-actin), så att filamenten blir >99% ADP46. Filamenten exponerades sedan kontinuerligt för 500 nM mCherry-cofilin-1 ensam, med 2 µM fullängds CAP1 eller med 10 µM N-CAP. På ImageJ konstruerades sedan kymografier av filamenten för att följa kärnbildning och sammansättning av enskilda cofilindomäner och avskiljningshändelser vid gränssnittet mot nakna aktinsegment.

För varje domän definierades tid 0 vid den ram där de kärnbildades. Vi registrerade sedan antingen den tidpunkt då de inducerade en avskiljningshändelse eller när de försvann på grund av avskiljning av en annan domän, sammanslagning eller censureringshändelse. Andelen domäner som inte har orsakat en avskiljningshändelse beräknades sedan med hjälp av en klassisk Kaplan-Meier-metod.

(2) Totalt antal avskiljningshändelser/µm (kompletterande fig. 3d). Inne i flödeskammare (mellan två täckglas som är åtskilda med dubbelhäftande tejp) injicerade vi först prepolymeriserade Alexa-488-märkta filament (i F-buffert, med 0,2-0,3 % metylcellulosa). Lösningen byttes sedan ut med 500 nM omärkt cofilin-1 och 0, 1 eller 10 µM NCAP. Efter utbytet analyserades de filament som fanns kvar nära ytan på följande sätt.

Antalet avskiljningshändelser per µm beräknades som den kumulativa funktionen

där Nsev(u) är antalet avskiljningshändelser vid tidpunkt u, och \(\mathop {\sum}\nolimits_i {l_{i(u)}}\) är summan över alla filament i av deras längd vid tidpunkt u. Eftersom lösningen inte innehåller G-actin depolymeriseras filamenten och filamentlängden minskar således med tiden.

Bindning av N-CAP till filamentens spetsiga ändar

Experimentet utfördes i flödeskammare (se Actin severing assay (2)), passiverad med biotin-PLL-PEG och funktionaliserad med neutravidin. F-actin (10 % Alexa-568, 1 % biotin) polymeriserades över natten vid 4 µM. Strax före injektion i kammaren späddes F-actin ner till 200 nM och blandades med 100 nM N-CAP-GFP, 2 µM cofilin-1 och 4 nM capping-protein, i F-buffert kompletterad med 0,2 % metylcellulosa. Bilder av aktinfilamenten togs före och efter en stream-acquisition av GFP-kanalen (5 bilder/sekund under 12 s, TIRF-mikroskopi). För analys av bindning till filamentändarna valdes blint aktinfilament som inte rörde sig under strömförvärvet ut. Fluorescensen mättes på de två ändarna av varje filament, på ett område på 3 x 3 pixlar. En bindningshändelse upptäcktes när fluorescensen överskred ett godtyckligt tröskelvärde (samma värde för alla filament och filamentändar). Eftersom kapningsproteinet borde skydda den taggiga änden, tillskrevs den spetsiga änden som den med flest bindningshändelser. N-CAP-GFP upptäcktes i 17 % av datapunkterna vid filamentens spetsiga ände, medan ospecifik förening av N-CAP-GFP i närheten av filamentens barberade ände upptäcktes i 1,7 % av datapunkterna. Överlevnadsfraktionen av N-CAP vid den spetsiga änden beräknades sedan och anpassades med en enkel exponential för att mäta den obundna hastigheten.

Kristallisering och strukturbestämning

Musens HFD-domän kristalliserades med 10×His-tag närvarande och renades enligt beskrivningen ovan, med undantag för användning av 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5 buffert i gelfiltrering. Provet koncentrerades till 7-10 mg/ml före kristallisering och blandades 1:1 med 0,1 M natriumkacodylat, 12 % PEG4000 (w/v), pH 6,1 i med hjälp av en sittande droppmetod med en droppstorlek på 200 nl i 96-väggsformat. Efter två veckors inkubation observerades stora nålliknande kristaller. För fjärrdatainsamling vid Diamond Light Source (UK, Didgot) vid strållinje I03 kryoskyddades kristallerna genom att blötläggas i modervätska innehållande 25 % glycerol och snabbfrystes i N2 för transport till strållinjen. Data samlades in vid 100 K med en våglängd på 0,9763 Å, Pilatus3 6M-detektor, 30 % transmissionseffekt, 0,05 s exponering och 0,1° svängningsvinkel, totalt 2400 bilder. Diffraktionsdata integrerades och skalades med X-ray Detector Software (XDS)54. Den ursprungliga lösningen erhölls med molekylär ersättning med hjälp av PHASER55 och PDB = 1s0p som sökmodell. En lösning med fyra HFD-domäner i en asymmetrisk enhet hittades, varefter flera omgångar av förfining med BUSTER56 och manuell uppbyggnad i COOT57 gav en god anpassning till data (se tabell 1). Ytterligare förbättringar uppnåddes genom att förädla data med införandet av translation-liberation-skruvparametrar (1/kedja), avlägsnande av icke-kristallografiska begränsningar och modellering av individuella atomära B-faktorer. Den slutliga Rwork/Rfree för modellen var 18,6 %/23,0 % med god övergripande geometri.

För kristallisering av trepartskomplexet (av ADP-actin, HFD-domän av mus CAP1 och C-terminal ADF-H-domän av mus twinfilin-1) framställdes ADP-actin i O/N-dialys vid +4 °C i 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM glukos, 0,5 mM β-mercaptoetanol, pH 8,0. Aktinlösningen, som innehöll 0,3 mM glukos och 5 U/ml hexokinas, överfördes till ett dialysmembran av typen Slide-A-Lyser och placerades på en flytanordning vid +4 °C. Nästa dag före komplexbildningen centrifugerades aktin i 20 minuter vid 355 040 × g med TLA-120-rotor. Proteinerna blandades i förhållandet 1:1,1,1:1,1 (aktin, HFD-domän, ADF-H-domän), koncentrerades till 10-20 mg/ml och användes för kristallisering enligt ovan. Träffar erhölls från flera olika förhållanden, och den bäst diffrakterande kristallen erhölls vid ~10 mg/ml koncentration av komplexet blandat 1:1 i 0,1 M HEPES, 0,1 mM KCl, 10 % PEG4000 (w/v), pH 7,0 med sittande droppstorlek på 200 nl. Den första dagen uppträdde flera små diamantformade kristaller i droppen. På den tredje dagen dök en stor stavliknande kristall upp medan alla små kristaller löstes upp. För datainsamling på distans vid Diamond Light Source (UK, Didgot) vid strålröret I03, kryoskyddades kristallerna genom att blötläggas i LV CryoOil (MiTeGen) och snabbfrystes i N2 för transport. Data samlades in vid 100 K med en våglängd på 0,9762 Å, Pilatus3 6M-detektor, 20 % transmissionseffekt, 0,05 s exponering och 0,15° svängningsvinkel, totalt 2400 bilder. Diffraktionsdata integrerades och skalades med XDS54. En första lösning erhölls med molekylär ersättning med hjälp av PHASER55 och PDB = 3daw som sökmodell som visade tydlig extra densitet i den spetsiga änden av aktinmonomeren. En ny molekylär ersättning genomfördes alltså, och en första modell för trepartskomplexet togs fram med hjälp av BALBES58 med 3daw och 1s0p som sökmodeller. Detta gav en lösning med Q = 0,787 och Rwork/Rfree = 29,7 %/35,6 %. Den asymmetriska enheten innehöll ett enda 1:1:1:1-komplex av HFD:ADF-H:ADP-actin. Flera omgångar av förfining med BUSTER56 och manuell uppbyggnad i COOT57, särskilt återuppbyggnad av D-slingan och anslutande slingor av α-helices i HFD-domänen krävdes för att förbättra modellen. Slutligen gav tillägg av vatten, införande av translation-libration-skruvparametrar (1/kedja) och modellering av individuella atomära B-faktorer en modell med en slutlig Rwork/Rfree på 16,6 %/19,4 % med god övergripande geometri.

Undersökning av protein-proteininteraktioner med hjälp av gelfiltrering

För att studera bindning av aktinmonomer framställdes ADP-G-actin enligt beskrivningen i ref. 34. Alla gelfiltreringsexperiment utfördes vid +4 °C med 0,5 ml/min löphastighet och 0,5 ml fraktionering med Superdex 200 increase 10/300 GL gelfiltreringskolonn som utjämnades i 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4. Hundra mikroliter komplex innehållande 18 µM ADF-H-domän av twinfilin och 15 µM andra proteiner injicerades i kolonnen och analyserades för eluering. Toppfraktioner analyserades också med SDS-PAGE. Konkurrensexperiment med aktinmonomer utfördes på samma sätt som ovan, genom att inkludera 15 µM C-CAP- eller CARP-domän i proverna. Toppfraktioner analyserades på SDS-PAGE, gelerna avbildades med ChemiDoc XRS + bildsystem (Bio-Rad) och kvantifierades med Image Lab (Bio-Rad).

Native-PAGE

Mini-Protean TGX 10 % geler (Bio-Rad) kördes i förväg i kyld körbuffert (25 mM Tris, 195 mM glycin, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) i 1 timme före laddning. Proverna förbereddes i ADP-actin dialysbuffert (5 mM HEPES eller Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glukos, 0,1 mM DTT, pH 8.0) i 20 µM koncentration av varje protein, blandas i förhållandet 1:1 med 2× laddningsbuffert (löpbuffert innehållande 20 % glycerol, bromfenolblått, inget ADP eller MgCl2) och appliceras sedan med en volym på 5 µl i 50 µl provbrunnar. Gelen kördes vid 100 V på is i 4 h.

Fluorometrisk test för nedmontering av aktinfilament

Den stationära nedmonteringen av ADP-aktinfilamenten utfördes enligt följande: 5 % pyren-actin polymeriserades i 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4 i 60 minuter. Filamentens barberade ändar täcktes med 50 nM täckprotein. Därefter tillsattes 0,5 µM cofilin (och 0,5 µM N-CAP), och reaktionen startades genom att tillsätta 4 µM D-vitaminbindande protein (monomersequestrerande medel). Slutkoncentrationen av aktin var 2,5 µM. Aktinets nedbrytning mättes genom att följa pyrenfluorescensen med excitation vid 365 nm och emission vid 407 nm på en fluorescensspektrofotometer (Agilent) under 2400 s vid 22 °C.

CD-spektrometri

CD-spektren för N-CAP vildtyp, mutanter och HFD-domänen mättes vid 20 °C med J-720-spektropolarimetern (Jasco), i 300 µl kvartskuvett med en ljusvägslängd på 0,1 cm, med följande parametrar: Fortsatt skanningsläge med skanningshastighet på 50 nm/min, bandbredd 0,5 nm, våglängdsintervall 190-260 nm, data pitch 0,5 nm. Alla proteiner späddes till 15 µM med 10 % PBS-buffert. Ackumulering av tio skanningar för varje protein har plottats som en enda kurva.

Modeller för atomistiska MD-simuleringar

De cofilin-dekorerade aktinmodellerna baserades på kryoelektronmikroskopistrukturen med en upplösning på 3,8 Å (PDBID: 5YU8)41. De saknade slingorna byggdes med hjälp av RosettaCM59 och RosettaScripts60 i närvaro av elektrontäthetskartan41 som påtvingar den tillhörande spiralformiga symmetrin. För att matcha de experimentella konstruktionerna i detta arbete ändrades aktin- och cofilinsekvenserna i detta skede från kyckling till kanin respektive mus. Över 1 000 modeller genererades. De sorterades sedan utifrån deras totala poäng och de som innehöll strukturella artefakter (t.ex. cis-peptidbindningar) filtrerades bort. Molekylär dynamik (MD)-simuleringar inleddes från de tre modellerna med högst poäng (kompletterande tabell 1, simuleringar F1-3).

HDFD-actinkomplexet isolerades från det kristalliserade HFD-domän/actin/twinfilin ADF-H-domänkomplexet och dockades separat på de utvalda cofilin-dekorerade aktinfilamentmodellerna som beskrivs ovan. För detta ändamål överlagrades det isolerade HFD-actinet på varje spetsig aktinmonomer, som sedan ersattes med HFD-actinet. På så sätt överförs kristallstrukturkonformationen hos aktin-HFD-dimeren till spetsen av det cofilin-dekorerade aktinet. De dockade modellerna förfinades först lokalt med hjälp av dockningsprotokollet61 , följt av begränsad relaxation med protokollet fast relax62 som distribueras med Rosetta Software Suite. Denna process tillämpades separat för varje cofilin-dekorerad aktinfilament som valts ut för MD-simuleringar (kompletterande tabell 1, simuleringar C1-3).

Konstruktion av det spetsiga ändsegmentet för MD-simuleringar

Varje simulering utfördes på ett spetsigt ändsegment av den utvalda cofilin-dekorerade aktinfilamentmodellen, som skapades genom att skära modellen vinkelrätt mot filamentets axel. Skärningsplanet valdes så att fyra hela ADP-Mg2+-bundna aktinmonomerer och tre hela cofilinmonomerer ingick i segmentet (kompletterande tabell 1, simuleringar F1-3). Segmentet innehöll också de två HFD-domänerna i den spetsiga änden i de HFD-bundna systemen (kompletterande tabell 1, simuleringar C1-3). Segmentet med den spetsiga änden innehöll också flera polypeptidfragment från cofiliner och aktiner vid dess taggiga ände (kompletterande figur 5a). För att bibehålla sin konformation och position under simuleringarna hölls dessa brutna kedjor positionellt begränsade under hela simuleringarna enligt följande: Ett lager av rester vid gränssnittet mot resten av det spetsiga ändsegmentet lämnades fritt; alla tunga atomer nära skärningsplanet och endast tunga atomer i ryggraden för regionerna däremellan begränsades med en kraftkonstant på 100 kJ/mol/nm2 (kompletterande fig. 5a). Dessa delvis fasthållna polypeptidfragment vid den taggiga änden fungerar som en plattform under simuleringarna. Detta tillvägagångssätt bibehåller både det filamentliknande protein-protein-gränssnittet vid den taggiga änden och filamentets orientering under simuleringarna.

Resternas protoneringstillstånd bestämdes vid neutralt pH baserat på pKa-beräkningar med hjälp av PROPKA363. Varje aktin H73-rest i aktin metylerades (Nτ-Metyl-l-histidin, HIC) och N-terminerna av aktin, cofilin och HFD acetylerades. Topologierna för varje molekyl i systemen förbereddes med LeAP-programmet som distribuerades med ambertools1864, som sedan konverterades till GROMACS-formatet med hjälp av ParmEd-verktyget.

Varje spetsig ändskiva som skapades från de utvalda modellerna placerades i en sexkantig prismasimuleringslåda med dess långa axel i linje med z-axeln. Lådans dimensioner valdes för att ha ett minsta avstånd på cirka 17 Å mellan filamentet och varje sida av lådan (kompletterande tabell 1). Varje system solverades med 0,15 M NaCl-lösning med antalet joner justerat för att neutralisera systemet.

För produktionskörningar utfördes steepest descent-minimering och successiva korta ekvilibreringssimuleringar (totalt ~7 ns) i NVT- och NpT-ensemblerna med hjälp av Berendsen- termostaten och barostat65. Harmoniska positionsbegränsningar tillämpades på den spetsiga ändskivan under dessa ekvilibreringssimuleringar. En mindre grupp atomer (alla tunga atomer, proteinets ryggrad och slutligen endast Cα-atomerna) begränsades i varje påföljande ekvilibreringssimulering med en kraftkonstant på 1000 kJ/mol/nm2.

De system som förgrenades från de andra (kompletterande tabell 1; C1′, C2′. F2′) framställdes genom att göra den lämpliga ändringen (dockning eller avlägsnande av HFD-domäner), ta bort de överlappande lösningsmedelsmolekylerna (när HFD-domäner dockades) och återjustera boxstorlek och lösningsmedelsatomer för den nya systemstorleken. Stegvis NVT- och NpT-ekvilibrering med begränsningar utfördes enligt ovan (totalt ~200 ps för simuleringar där HFD-domäner avlägsnades, och totalt ~4 ns när den är dockad).

Alla produktionskörningar utfördes för 1-2.5 μs i NpT-ensemblen med endast de tidigare nämnda positionsbegränsningarna på plattformsregionen.

Kraftfält och parametrar i MD-simuleringar

Följande kraftfält och parameteruppsättningar användes i MD-simuleringarna: Amber ff14sb66 för proteinerna, TIP3P-modellen67 för vatten, parameteruppsättningen för monovalenta joner av Joung och Cheatham68 för Na+ och Cl-, en oktaedrisk multisit-jonmodell av Saxena och Sept69 för Mg2+ och en parameteruppsättning för polyfosforylerade föreningar av Meagher et al.70 för ADP. Saknade bindningsparametrar för metylhistidin (Nτ-Metyl-l-histidin, HIC) antogs från kraftfältet GAFF264. De atomära laddningarna beräknades enligt protokollet av Duan et al.71 R.E.D.III.5-programvaran72 användes för inpassning av RESP (restrained electrostatic potential) för flera konformationer med hjälp av en förlängd och en α-helikal konformation av HIC-dipeptid (Ace-HIC-Nme). Alla kvantkemiska beräkningar utfördes med hjälp av programsviten Gaussian0973 på teorinivån b3LYP/cc-pVTZ. Laddningsberäkningar utfördes med IEFPCM-modellen i ett polariserbart kontinuum med en dielektricitetskonstant på 4 genom att lösningsmedlet ställdes in som eter.

MD-simuleringsprotokoll

Alla simuleringar utfördes med GROMACS 2018 74. Rörelseekvationerna integrerades med hjälp av en hoppgropsalgoritm med ett tidssteg på 2 fs. Alla bindningar begränsades med hjälp av LINCS-algoritmen75. Simuleringsprotokollen valdes enligt ref. 66. Elektrostatiska interaktioner med lång räckvidd behandlades med Ewald-schemat med slät partikelmask76 med en avgränsning i realrymden på 0,8 nm, ett Fourier-avstånd på 0,12 nm och en interpolation av fjärde ordningen. Lennard-Jones-potential med en avgränsning på 0,8 nm användes för van der Waals-interaktioner. Långväga dispersionskorrigeringar tillämpades för energi och tryck77.

Alla produktionssimuleringar utfördes i NpT-ensemblen. Den spetsiga ändskivan, plattformen och lösningsmedlet (vatten och 0,15 M NaCl) kopplades till separata temperaturbad vid 310 K med hjälp av Nosé-Hoover-termostaten78,79 med en tidskonstant på 1,0 ps. Isotropisk tryckkoppling utfördes med hjälp av Parrinello-Rahman-barostaten80 med ett referenstryck på 1 atm, en tidskonstant på 5 ps och en kompressibilitet på 4,5 × 10-5 bar-1.

Analys av MD-simuleringarna

Alla analyser utfördes med hjälp av VMD81 och interna skript. MMGBSA-beräkningarna utfördes med hjälp av programvaran MMPBSA.py82 som distribueras med ambertools1864 och använde den modifierade GB-modellen som utvecklats av Onufriev et al.83 med 0,15 M saltkoncentration (ramar samplade var 100:e ns med bortseende av de första 500 ns av varje simulering).

Strukturella analyser

För att analysera olika aktinstrukturer och deras konformationstillstånd som presenteras i fig. 1d följde vi protokollet från Tanaka et al41,84. med F-aktinstrukturen (PDB 6djo) som referens.

Statistisk analys och reproducerbarhet

Data i figurerna 2d, 4b och 4d sammanfördes från flera experiment som utfördes olika dagar och representerar därmed data från flera oberoende experiment. Panelerna 2f, 2g, 2h och 3d presenterar data som analyserats från ett enda representativt experiment. n beskriver antalet filament som analyserats för panelerna 2d, 2f, 2g, 4b och 4d. n i panel 6c motsvarar antalet gånger experimentet utfördes.

Experimenten i de kompletterande figurerna 2a-d, 3c, 6a-d utfördes med liknande resultat minst två gånger. Experimenten i 3d, experimentet med CARP-domänkonkurrens i 6a och experimenten under monteringsfrämjande förhållanden i fig. 7 utfördes en gång.

Rapporteringssammanfattning

Fördjupad information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till den här artikeln.