Mål:

1. Att skilja mellan de två huvudkategorierna av bakterier: Grampositiva och gramnegativa.
2. För att förstå hur Gramfärgreaktionen påverkar grampositiva och gramnegativa bakterier baserat på de biokemiska och strukturella skillnaderna i deras cellväggar.

Klicka för att se animationen

Färgning är en hjälpteknik som används i mikroskopiska tekniker som används för att öka tydligheten i den mikroskopiska bilden.Färgämnen och färgämnen används ofta på det vetenskapliga området för att framhäva strukturen hos biologiska prover, celler, vävnader etc.

Det mest använda färgningsförfarandet inom mikrobiologin är Gramfärgningen, som upptäcktes av den danske vetenskapsmannen och läkaren Hans Christian Joachim Gram år 1884. Gramfärgning är en differentiell färgningsteknik som skiljer bakterier åt i två grupper: grampositiva och gramnegativa. Förfarandet bygger på mikroorganismernas förmåga att behålla färgen på de färgämnen som används under gramfärgningsreaktionen. Gramnegativa bakterier avfärgas av alkoholen och förlorar färgen på den primära färgämnet, lila. Grampositiva bakterier avfärgas inte av alkoholen och förblir lila. Efter avfärgningssteget används en motfärgning för att ge de avfärgade gramnegativa organismerna en rosa färg.

Fig: Hans Christian Joachim Gram

Betydelsen av en Gram-färgning:

Gram-färgningen är ett mycket viktigt preliminärt steg i den första karakteriseringen och klassificeringen av bakterier. Det är också ett nyckelförfarande vid identifiering av bakterier baserat på färgningsegenskaper, vilket gör det möjligt att undersöka bakterierna med hjälp av ett ljusmikroskop. De bakterier som finns i ett ofärgat smet är osynliga när de betraktas med ett ljusmikroskop. När de är färgade kan bakteriernas morfologi och arrangemang också observeras. Vidare är det också ett viktigt steg vid screening av smittämnen i kliniska prover, t.ex. direkta utstryk från en patient.

Gramfärgningsförfarandet gör det möjligt för bakterier att behålla färgen på färgämnena, baserat på skillnaderna i cellväggens kemiska och fysikaliska egenskaper.

1. Grampositiva bakterier: Färgar mörklila på grund av att de behåller det primära färgämnet Crystal Violet i cellväggen.

Exempel: Staphylococcus aureus

Fig: Grampositiva bakterier

2. Gramnegativa bakterier: De färgas rött eller rosa genom att de behåller det färgämne som kallas Safranin.

Exempel: Bakterier: De färgas rött eller rosa genom att de behåller det färgämne som kallas Safranin: Escherichia coli

Fig: Gramnegativa bakterier

Bakteriemorfologi:

Bakterier är mycket små encelliga mikroorganismer som finns överallt i naturen. De är mikrometerstora (1µm = 10-6 m). De har cellväggar som består av peptidoglykan och förökar sig genom binär fission. Bakterier har olika morfologiska egenskaper.

De vanligaste morfologierna är:

Coccus (pleural: Cocci):

Sfäriska bakterier; kan förekomma i par (diplococci), i grupper om fyra (tetracocci), i druvliknande klungor (Staphylococci), i kedjor (Streptococci) eller i kubiska arrangemang av åtta eller fler (sarcinae).

Till exempel: Exempel: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleural: Bacilli):

Stavformade bakterier; förekommer i allmänhet ensamma, men kan ibland förekomma i par (diplo-bacilli) eller kedjor (streptobacilli).

Till exempel: Exempel: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleural: Spirilla):

Spiralformade bakterier

Till exempel: Vissa bakterier har andra former, t.ex.:

Koccobaciller: Långsträckta sfäriska eller ovala former.

Filamentösa: Bakterier som förekommer i långa kedjor eller trådar.

Fusformiga: Bakterier som förekommer i långa kedjor eller trådar.

Fusformade: Spirillum, Vibrio och Spirochete: Baciller med avsmalnande ändar.

Fig: Olika bakteriella morfologier

Gram Stain Mechanism:

Gram Positive Cell Wall:

Gram-positiva bakterier har en tjock nätliknande cellvägg som består av peptidoglykan (50-90 % av cellväggen), som färgas lila. Peptidoglykan är huvudsakligen en polysackarid som består av två underenheter som kallas N-acetylglukosamin och N-acetylmuraminsyra. När intilliggande lager av peptidoglykan bildas korslänkas de av korta kedjor av peptider med hjälp av ett transpeptidasenzym, vilket resulterar i cellväggens form och styvhet. Det tjocka peptidoglykanskiktet hos grampositiva organismer gör att dessa organismer kan behålla kristallviolett-jodkomplexet och färgar cellerna lila.

Lipoteikosyra (LTA) är en annan viktig beståndsdel i cellväggen hos grampositiva bakterier som är inbäddad i peptidoglykanskiktet. Den består av teikosyror som är långa kedjor av ribitolfosfat som är förankrade i lipidbilagan via en glycerid. Den fungerar som regulator för autolytiska väggenzymer (muramidaser: Bakteriella enzymer som finns i cellväggen och som orsakar sönderdelning av cellen efter skada eller död.)

Medicinsk relevans av grampositiv cellvägg:

LTA har också antigena egenskaper som stimulerar specifika immunresponser när den frigörs från cellväggen efter celldöd. Celldöd beror oftast på lysis som induceras av lysozymala aktiviteter, katjoniska peptider från leukocyter eller beta-laktamantibiotika.

Gramnegativ cellvägg:

Gramnegativa bakterier har ett tunnare lager peptidoglykan (10 % av cellväggen) och förlorar kristallviolett-jodkomplexet under avfärgning med alkoholsköljning, men behåller motfärgningen Safranin, vilket gör att de framträder rödaktigt eller rosa. De har också ytterligare ett yttre membran som innehåller lipider och som är separerat från cellväggen med hjälp av det periplasmatiska utrymmet.

Medicinsk relevans av gramnegativa cellväggar:

Cellväggen hos gramnegativa bakterier är ofta en virulensfaktor som gör det möjligt för sjukdomsalstrande bakterier att orsaka sjukdom. Gramnegativa bakteriers virulens är ofta förknippad med vissa komponenter i cellväggen, särskilt lipopolysackariden (även känd som LPS eller endotoxin). Hos människor framkallar LPS ett medfött immunsvar som kännetecknas av cytokinproduktion och aktivering av immunsystemet. Inflammation uppstår som ett resultat av cytokinproduktionen, vilket också kan ge upphov till värdtoxicitet.

Stainreaktion:

De fyra grundläggande stegen i Gram-färgningen är:

1) Applicering av den primära färgämnet kristallviolett (CV) på ett värmefixerat smet av en bakteriekultur.

CV dissocieras i vattenlösningar till CV+ och Cl – joner. Dessa två joner tränger sedan igenom cellväggen och cellmembranet hos både grampositiva och gramnegativa celler. CV+-jonerna interagerar senare med negativt laddade bakteriekomponenter och färgar bakteriecellerna lila.

2) Tillsats av Grams jod.

Jod (I – eller I3 -) fungerar som ett betningsmedel och som ett fångstmedel. Ett betningsmedel är ett ämne som ökar cellväggens affinitet för en färgämne genom att binda till det primära färgämnet och på så sätt bilda ett olösligt komplex som fastnar i cellväggen. I Gram-färgreaktionen bildar kristallviolett och jod ett olösligt komplex (CV-I) som gör att utstryket får en mörklila färg. I detta skede blir alla celler lila.

3) Avfärgning med 95 % etylalkohol.

Alkohol eller aceton löser upp det yttre lipidmembranet hos gramnegativa bakterier, vilket gör att peptidoglykanskiktet blottas och cellväggens porositet ökar. CV-I-komplexet tvättas sedan bort från det tunna peptidoglykanskiktet, vilket gör att gramnegativa bakterier blir färglösa.

Å andra sidan har alkohol en uttorkande effekt på cellväggarna hos grampositiva bakterier, vilket gör att porerna i cellväggen krymper. CV-I-komplexet blir fast bundet i den flerskiktade, starkt tvärbundna grampositiva cellväggen och färgar därmed cellerna lila.

Det avfärgade steget måste utföras noggrant, annars kan överavfärgning ske. Detta steg är kritiskt och måste timas korrekt, annars avlägsnas kristallviolettfärgen från de grampositiva cellerna. Om avfärgningsmedlet appliceras på cellen under för lång tid , kommer de grampositiva organismerna att framstå som gramnegativa. Underavfärgning inträffar när alkoholen inte lämnas på tillräckligt länge för att tvätta ut CV-I-komplexet från de gramnegativa cellerna, vilket resulterar i att gramnegativa bakterier framstår som grampositiva.

4) Motfärgning med safranin

De avfärgade gramnegativa cellerna kan synliggöras med en lämplig motfärgningsfärg, vilket vanligen är positivt laddat safranin, som färgar dem rosa. Den rosa färgen som fastnar på de grampositiva bakterierna maskeras av den lila färgen från kristallviolett (Basic fuschin används ibland i stället för safranin i sällsynta situationer).