Innehåll och egenskaper hos intracellulär vätska

Detta kapitel är vagt relevant för avsnitt E(iv) i 2017 års kursplan för CICM Primary Syllabus, som förväntar sig att examinanden ska ”beskriva sammansättningen …av intracellulär vätska”. Eftersom detta är avsnittet om cellfysiologi kommer fokus här främst att ligga på den mikroorganisatoriska nivån, och all diskussion om den intracellulära kroppsvätskekomponenten kommer att lämnas till avsnittet om kroppsvätskor.

Det faktum att de som avlägger högskoleprov aldrig har fokuserat sitt öga på detta ämne ger en nästan befriande känsla av meningslöshet åt diskussionen om det, eftersom både provdeltagarna och författaren är behagligt medvetna om att var och en av dem slösar bort den andras tid. Istället för att ta del av den hårda vetenskapen och memorera fakta som är möjliga att examinera här, kan man lätt läsa vidare av rent underhållningsmässiga skäl, eller hoppa vidare till ämnen som lockar till sig fler poäng.

Sammanfattningsvis:

Vilka giltiga peer-reviewed resurser finns för detta ämne? Tyvärr är de många. När man använder en sökmotor eller indexavsnittet i en lärobok för att slå upp ”intracellulär vätska” finns det oundvikligen ett svar, en rad poster eller sidor eller powerpoint-slides som – även om de alla är vagt likartade till sitt innehåll – skiljer sig åt i sina citerade värden och som inte erbjuder något i form av referenser. Många erbjuder ingen användbar information alls. Om man till exempel vänder sig till de officiella högskoleböckerna i ämnet (Ganong, s. 2 i 23:e upplagan, och Guyton & Hall, s. 4 i 13:e upplagan) finner man att cytosoliska elektrolytkoncentrationer diskuteras med hjälp av termer som ”stora mängder”. Även utanför den officiella bibliografin finns det inga raka svar i annars solida verk som Molecular Biology of the Cell. De kan inte ens enas om vad de ska kalla det (cytosol? Protoplasma? Primordialschlauch?)

Troligtvis finns det fortfarande forskare som publicerar om detta ämne. Den bästa artikeln är förmodligen artikeln från 1999 av Katherine Luby-Phelps, som i princip innehåller allt du kan tänkas behöva för att besvara alla hypotetiska framtida SAQs om detta ämne. Ett annat utmärkt inlägg som främst handlar om egenskaperna hos det intracellulära materialet är den korta artikeln av Richard P. Sear (2005). Om man verkligen är galen och har tidsresurser som en fast anställd specialist (dvs. ingen brådskande skyldighet att faktiskt utföra något användbart arbete) kan man i stället utforska Gilbert Lings In Search of the Physical Basis of Life (1984), en 800-sidig bok skriven av en man vars publikationer om cellfysiologi sträcker sig ända in på 1950-talet.

Volym av ett intracellulärt utrymme

Hur stor är en cell? Det beror naturligtvis på cellen. Ett bra exempel på en avvikande cell är Xenopus oocyt, ägget från en afrikansk klövpadda, som är 1 mm i diameter. När man diskuterar människor brukar man referera till intracellulär vätska som om det vore en relativt homogen hink, men i själva verket består detta vätskefack av något som liknar 1014 minikroppiga fack som vart och ett har en något annorlunda volym och sammansättning.

Heterogeniteten hos alla dessa volymer sammanfattas väl i detta kapitel i BioNumbers-databasen, där man kan hitta alla möjliga sorters minutiöst refererade information. Det återges här med minimala ändringar, ifall Harvard-servrarna någonsin skulle krascha.

Volymer av däggdjursceller

Celltyp	Volym (μm3, eller femtoliter)	Volym (picoliter)	Referens
Spermacell	30	0.03	Gilmore et al, 1995
Erythrocyt	100	0.1	Ballas et al, 1987
Lymphocyt	130	0.13	Schmid-Schonbein et al, 1980
Neutrofil	300	0.3	Rosengren et al, 1994
Pankreas β-cell	1 000	1.0	Finegood et al, 1995
Enterocyter	1 400	1,4	Wiśniewski et al, 2012
Fibroblast	2 000	2.0	Mitsui et al, 1976
Cervikal tumör (HeLa)	3,000	3.0	Zhao et al, 2008
Hårcell (öra)	4,000	4.0	Géléoc et al, 1999
Osteoblast	4,000	4.0	Beck et al, 2011
Alveolär makrofag	5,000	5.0	Krombach et al, 1997
Kardiomyocyter	15 000	15,0	Calvillo et al, 2003
Megacaryocyter	30 000	30.0	Harker et al, 2000
Adipocyter	60 000	60.0	Livingston et al, 1984
Oocyte	4 000 000 000	4000	Goyanes et al, 1990

Så, det är ett ganska brett intervall. Dessutom kommer uppenbarligen inte allt innehåll i cellen att upptas av ”intracellulär vätska”, oavsett vilken definition du har av den termen. I detta kapitel kommer definitionen av intracellulär vätska till exempel att vara ”intracellulärt innehåll som inte är organeller”, enbart på grund av att organellerna diskuteras i ett annat kapitel. Vad vi talar om i det fallet är den ”gråaktiga, viskösa, slemmiga, halvtransparenta och halvflytande substans” som upptar det intracellulära utrymmet mellan andra strukturer (Harvey, 1937).

Avhängigt av vilken typ av cell man tittar på kan det utrymmet vara en mycket liten del av den totala volymen. Till exempel i den ovan nämnda omentala adipocyten kommer den stora majoriteten av de 60 pikoliterna av den totala volymen att upptas av vattenlöst fett. Detta kan bevisas experimentellt: DiGirolamo & Owens (1976) kunde beräkna att vattenvolymen i råttans adipocyter var ca 5-7 % av den totala volymen, dvs. 1,5-2 picoliter.

Kort sagt, vi tittar på en mycket liten volym. Varför spelar det någon roll? Jo. Cellens inre vätskevolym 1-2 pikoliter vätskevolym är fördelningsvolymen för lösliga ämnen. Molekylerna av dessa ämnen har därför en mycket kort sträcka att färdas innan de möter varandra. Effekten är att reaktionshastigheten ökar, vilket är bra eftersom den totala mängden reagensmolekyler för en så liten volym med nödvändighet är liten. För att låna ett exempel från Luby-Phelps (2000): Om en cell har ett totalt innehåll av 1 nanomol av ett protein innebär det att det endast finns 1 000 kopior av det proteinet i cellen. Lyckligtvis skulle en bindningsmolekyl med även låg affinitet kunna ta upp och adsorbera majoriteten av det tillgängliga substratet med en så liten volym som den måste genomkorsa, även om den har låg affinitet.

Proteininnehållet i den intracellulära vätskan

Okej, så volymen är liten. Vilka makromolekyler finns i den och hur många av dem? Alice B. Fulton (1982) svarade på den här frågan med det förmodligen tydligaste svaret i den publicerade litteraturen. I grund och botten ligger proteininnehållet i celler i intervallet 17-35 viktprocent, med de flesta författare som hamnar i intervallet någonstans mellan 20-30 g/100 ml. Fulton citerar gamla texter (Loewy et al, 1969) för att ge följande värden:

• Muskelceller: 23 viktprocent protein
• Erythrocyter: Mätningarna görs vanligtvis genom mätning av brytningsindex, vilket är en teknik som vanligtvis inte skiljer mellan strukturella proteiner (t.ex. de som cytoskelettet och organellerna består av) och lösliga proteiner som utgör resten av goo.

  Så, vad är poängen med den här diskussionen? Jo. Denna koncentration av protein är ganska hög. Den ligger över den vanligtvis accepterade koncentrationen av stora polymerer som skulle förväntas påverka diffusionen av andra liknande polymerer, dvs. skogen är för tät. Chang et al (1987) har tagit fram en matematisk modell som förutspår att för polymerer på 50 kDa och högre ligger diffusionsgränsen på cirka 130 g/L, dvs. om man överskrider den gränsen kommer andra polymerer inte att kunna diffundera lätt genom lösningen. Visst använde de polystyren upplöst i bensen, men faktum kvarstår. Som jämförelse kan nämnas att när man fullständigt kristalliserar ett protein får man en ”fast substans” som endast består av 40 viktprocent protein

  Sammanfattningsvis är proteinerna i den intracellulära vätskan packade så tätt att cytosolen måste beskrivas som en ”trängd lösning”. Det tecknade diagrammet här (ursprungligen publicerat av Goodsell 1993, och därefter reproducerat av praktiskt taget alla som någonsin skrivit om cytosol) visar visuellt exakt hur tätt packade dessa kroppar är. Ritningen var approximerad, med hjälp av kända storlekar och former av molekyler/elektronmikroskop, men bilder tagna genom SEM (t.ex. av Bridgman & Reese, 1984) visar att den korrekt representerar cytosolens röriga mikrostruktur. När man tittar på Xenopus oocyter vid en förstoring på ~ 80 000 syns en tät skog av filament och granuler. Bilden här (en del av deras figur 6) rensades faktiskt upp lite genom celllys och tvätt med tvättmedel, för att avlägsna en del av den proteinbelastning som annars skymde den finare strukturen. Pilarna pekar på filamentens Y- och T-kopplingar.

  

  Och utan tvättmedelsberedning blir allt det fina granulära materialet som är packat mellan dessa filament synligt. Bilden liknar nu vitt brus (samma författare).

  

  Det är uppenbart att diffusionen genom detta tjocktäcke inte kommer att vara normal. Mindre lösningsmedel (t.ex. dina natrium- och kaliumjoner) måste navigera runt dessa enorma hinder och ta den natursköna vägen mot varandra. Ur praktisk synvinkel bör detta innebära att alla reaktioner som är beroende av diffusionshastigheten kommer att bli långsammare. Om molekylerna tar en evighet på sig för att nå varandra, borde väl nettohastigheten för deras växelverkan minska. Vi ser dock inte detta.

  Vilka kemiska egenskaper ser vi, med denna högt mättade proteinsoppa? Allen P. Minton (2006) har sammanfattat flera års (huvudsakligen hans egen) forskning i en tabell i den ovan refererade artikeln. Den sammanfattas här:

  • Ökad bindningsaffinitet hos annars utspädda makromolekyler för varandra
  • Acceleration av proteinassociationer t.ex. Självmontering
  • Fördröjning av diffusionsbegränsade reaktioner och proteinassociationer
  • Stabilisering av proteiner mot denaturering genom värme

  Sammanfattningsvis tvingar trängseln proteiner att veckas och interagera, vilket ger upphov till komplexa konfigurationer som annars skulle vara omöjliga i en utspädd lösning. Till exempel upptäckte Wilf & Minton 1981 att utspädda myoglobinmolekyler i lösning har lite intresse för varandra, men att tillsättandet av en 10-procentig lösning av (vilket som helst!) annat protein får myoglobinet att spontant samlas till dimerer.

  Egenskaper hos intracellulärt vatten

  Även i ett kristalliserat protein är endast 40 % av massan faktiskt protein. Resten är lösningsmedel som upptar utrymmena mellan packade proteinmolekyler (de är inte exakt rektanglar och ligger inte snyggt på varandra). När lösningsmedlet är vatten, blir hälften av lösningsmedlet adsorberat på proteinytan, men resten kan fortfarande betraktas som normalt flytande vatten. I denna tunna film är jonerna i det intracellulära vattnet upplösta.

  

  Det är tydligt att med det bundna adsorberade vattnet är saker och ting något annorlunda. Till exempel kommer lösningsmedelsegenskaperna hos detta vatten inte att vara exakt desamma som hos ”fritt” vatten. För det första kommer det förmodligen att ha minskad kemisk aktivitet. Som man kan förvänta sig ger vattnets ”ordnade” tillstånd det flera ovanliga kolliativa egenskaper – till exempel fann Foster et al (1976) att dess fryspunkt är sänkt. Dessutom kommer det att finnas fickor av cytosol med ökad aktivitet (kring hydrofila proteinstrukturer) och minskad aktivitet (kring de hydrofoba).

  Hur stor del av vattnet hålls i detta fångsttillstånd av proteinerna? Det är något svårt att säga. Experiment av Ling et al (1993) tyder på att inne i cellerna är det mesta av vattnet ”ordnat” på detta sätt, men de flesta experiment som rapporterar om detta ämne påverkas till viss del av att de råa levande celler som de använder har olika homeostatiska reaktioner på försöksförhållandena, vilket förvirrar resultaten.

  Generellt försöker man fastställa detta svar genom att osmotiskt dehydrera celler. Tillämpa ett osmotiskt tryck, resonerar de, och allt ”rörligt” vatten borde komma ut ur cellen. Sedan mäter man cellens vatteninnehåll, och allt som blir kvar måste vara ”immobilt”, parkerat på ytan av proteinmolekyler och oförmöget att vandra som svar på det osmotiska trycket. Cameron et al (1997) presenterar ett diagram (stulet skamlöst och visas här, till vänster) där vatteninnehållet i de återstående cellerna plottas mot en x-axel med ökande osmotiskt tryck. När linjen mellan tryck och återstående vatten extrapolerades från experimentella bevis och förlängdes mot ett ”oändligt” osmotiskt tryck, slutade linjen med att korsa y-axeln vid någon punkt som inte var noll. Beroende på vilka celler man använde slutade detta med att vara någonstans mellan 30-90 procent av det totala vatteninnehållet.

  I själva verket verkar det som om detta vatten som adsorberas på proteiner är det essentiella vattnet i cellerna, och allt ”fritt” vatten är meningslös ballast. Clegg (1981), som rehydrerade några torkade saltvattenräkorceller, fann att den metaboliska aktiviteten återupptogs och var relativt normal när cellerna återställdes med ca 35 viktprocent vatten, dvs. ungefär lika mycket som man förväntar sig för att ”hydrera” alla makromolekyler. I dessa räkor fanns det med största sannolikhet inget fritt vatten i ”bulkfasen”. Visst, de försökte inte reproducera sig eller syntetisera RNA (vilket krävde en hydrering på upp till 70-80 %), men deras syntes av aminosyror och gasutbyte pågick relativt normalt. Detta gör det ännu mer anmärkningsvärt att denna tjocka soppa med 20-30 % protein har en viskositet som närmast liknar normalt vatten när den mäts objektivt (Luby-Phelps, 1994)

  Intracellulär vätska pH

  Carter (1972) publicerade en mycket inflytelserik artikel om detta, som ofta citeras i läroböcker i humanfysiologi, trots att författaren använde muskler från jättelika havstulpan (Balanus nubilus) som han suspenderade i något som kallas ”havstulpan Ringer-lösning”, en saltlösning med 450 mmol/L natrium och 518 mmol/L klorid. Man kan knappast läsa vidare med någon som helst respekt för att sådana uppgifter är generaliserbara för människor, men om man gör det upptäcker man den viktigaste upptäckten: att pH-värdet i cellerna är så pass uppdelat att olika områden i cytosolen har helt olika pH-värden, i intervallet 6,0 till 7,5.

  Intracellulära elektrolytkoncentrationer

  I allmänhet kommer alla läroböcker, när man frågar om elektrolytkoncentrationen i den intracellulära vätskan, att producera ett Gamblegram som detta (förskingrat från Ling, 1984, utan tillstånd från hans dödsbo eller förlag).

  

  Detta diagram här refereras inte i Lings bok, men man skulle kunna hävda att det inte behöver vara det, med tanke på att Ling gjorde praktiskt taget allt banbrytande arbete för att bestämma beteendet hos intracellulära lösningsmedel. Närmare bestämt fastställde han och Ochsenfeld på 1960-talet att detta kalium (och alla andra elektrolyter i cytosolen) i allmänhet inte finns i en fritt tillgänglig form, utan i stället adsorberas på de makromolekylära strukturerna.

  

  Forskarna utmanade cellerna med radioaktivt märkta isotoper och fann att detta hade liten effekt när det gällde att förskjuta de elektrolyter som redan fanns där, vilket man skulle ha förväntat sig om de hade varit fritt fördelade. De intracellulära elektrolyterna finns till stor del i komplex med makromolekyler och är mycket mindre rörliga än vad man skulle kunna förvänta sig av en modell av en cell där allt innehåll existerar i en homogen vattensäck. Samma författare (Ling & Ochsenfeld, 1973) bekräftade senare att rörligheten för kalium från det intracellulära till det extracellulära kompartmentet var ungefär en åttondel av vad man skulle kunna förvänta sig av enkel diffusion i fri lösning. Dödad grodmuskel läckte kalium något lättare (diffusionshastigheten minskade bara med 25 % från den förväntade), eftersom ATP-drivna pumpar slutade fungera och proteinstrukturen blev oorganiserad.

  Så, låt oss komma överens om att dessa joner inte är lösta i en skvalpande sjö av fritt intracellulärt vatten, utan snarare är bundna i komplex. Det ger fortfarande inget svar på frågan: hur mycket av vad finns där? Det visar sig att den frågan är relativt lätt att besvara. Mycket lättare faktiskt än någon av de andra frågorna som tagits upp hittills i detta kapitel. Man behöver bara ta sin cytosol, frystorka den och sedan mäta den torra massans elementära sammansättning. Mason et al (1981) gjorde exakt detta för några njurtuberkuloceller, före och efter ischemisk skada. Deras resultat återges nedan, både i form av den ursprungliga tabellen från 1981 och ett fint glänsande Gamblegram:

  

  

  Som man kan se av de vilda fluktuationerna i kaliumkoncentrationen efter till och med 20 minuters ischemi är cellernas elektrolytsammansättning mycket mer flytande än den extracellulära vätskans (där en förändring på 20 mmol i koncentrationen av någon elektrolyt skulle tolereras dåligt, på en existentiell överlevnadsnivå för organismer). Dessutom kommer varje cellgrupp att ha en något annorlunda intracellulär jonkoncentration. Detta ger upphov till att de intracellulära elektrolytvärden som diskuteras i läroböckerna är oprecisa, och att de generellt sett är ovilliga att ange några siffror. Praktiskt taget alla siffror som du anger kommer att vara felaktiga. Till exempel hade Masons distala tubuli 11 mmol/L natrium i sin cytosol, men Poole-Wilson (1975) fann cirka 44 mmol/L i vänster ventrikelmyocyter och 20 mmol/L i vänster quadriceps. Alam et al (1977) anger värden på cirka 25 mmol/L för natrium och 145 mmol/L för kalium i vissa sviktande leverceller. Kort sagt, den röriga och oförutsägbara miljön i en given cell gör det svårt att ange specifika siffror.