In vivo RyR1-reduktion i muskler utlöser en kärnliknande myopati

Generering av RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2-musmodell

En muselinje med loxP-platser insatta på båda sidorna av exon 9-11 i RYR1-genen (så kallad RyR1Flox/Flox) parades med muselinjen HSA-Cre-ERT2 som uttrycker det tamoxifenberoende Cre-ERT2-rekombinaset under kontroll av den humana α-actin-genen för skelettmuskulatur , för att skapa RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2. Tamoxifeninjektion inducerar aktivering av Cre-ERT2-rekombinaset selektivt i skelettmuskulaturen, vilket resulterar i deletion av exon 9-11 och avbrott i RYR1-genen i skelettmuskulaturen med ett strikt tamoxifenberoende (fig. 1a). Vid födseln var RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2-möss normala, och vid två månaders ålder, en gång unga vuxna, inducerades rekombinationen genom tamoxifeninjektion (från och med denna tidpunkt kallades de rekombinerade djuren RyR1-Rec). Molekylära och fysiologiska konsekvenser studerades vidare som en funktion av tiden, upp till 105 dagar efter induktion av rekombination (fig. 1b). Kontrolldjur (CTRL) är kullsyskon RyR1Flox/Flox (utan HSA-Cre-ERT2-transgen) som injicerats med tamoxifen. Den övergripande fenotypen hos de rekombinerade mössen vid 75 dagar kännetecknas av en kyfos i samband med en onormal rörlighet hos bakbenen och en vinglig gång. Djuren kan fortfarande stå på bakfötterna för att äta, men matpellets hade systematiskt givits direkt i buren när sjukdomen fortskred. Efter 105 dagar är djuren fortfarande rörliga i sina burar och ingen ökad dödlighet har observerats jämfört med CTRL. Både hanar och honor var drabbade. Den relativa mängden RyR1 på mRNA-nivå analyserades i quadricepsmuskeln var 15:e dag efter rekombinationen med hjälp av RT-q-PCR i CTRL- och RyR1-Rec-djur (fig. 1c). En snabb minskning av RyR1 mRNA observerades, med en låg och stabil nivå på 21 % ± 4 % av det ursprungliga värdet som uppnåddes redan 3 dagar efter tamoxifeninjektion. En minskning observerades i alla testade muskler 75 dagar efter rekombinationsinduktion (Quadriceps, tibialis anterior, EDL, soleus, Additional file 1: Fig. S1A). Mängden RyR1-protein analyserades ytterligare med hjälp av kvantitativt Western blot i homogenat från quadricepsmuskeln (fig. 1d, e). Denna mängd minskade successivt och nådde ungefär 50 % av det ursprungliga värdet efter 105 dagar. Ingen ytterligare minskning av RyR1-protein observerades vid längre tidsperioder (data visas inte). Mängden RyR1-protein kvantifierades i olika muskelhomogenat 75 dagar efter rekombination. En minskning observerades i alla undersökta muskler, även om den återstående mängden skiljde sig något mellan musklerna, den högsta i interosseus (64 % ± 5 %) och den lägsta i soleus (33 % ± 5 %) (Additional file 1: Fig. S1B).

RyR1-Rec-möss uppvisar progressiv minskning av muskel- och kroppsvikt och muskelstyrka

Konsekvenserna av RyR1-reduktionen studerades först på hela djurnivå. CTRL-djuren, som inledningsvis hade samma vikt, ökade långsamt i vikt från 24,4 ± 0,4 till 30,6 ± 0,8 g vid D90, medan RyR1-Rec-djuren successivt tappade i vikt till 20,6 ± 1,3 g vid D90 (fig. 2a). Både hanar och honor påverkades och förlorade cirka 13 % av sin ursprungliga kroppsvikt efter 75 dagar (Additional file 1: Fig. S1C). Detta är resultatet av en viktförlust som observerades i alla muskler (Additional file 1: Fig. S1D). För att testa den totala muskelprestationen efter RyR1-reduktion utsattes djuren för två olika styrketester. De fick först hänga och greppa en tvärgående yta med alla fyra tassar i upp till 5 minuter, varvid latenstiden för att falla avspeglar muskelkraften. Grepptestet som utfördes varje vecka under 105 dagar (fig. 2b) visade att RyR1-Rec-djuren började förlora styrka 20-30 dagar efter tamoxifeninjektionen, när RyR1-mängden var cirka 75-80 % av det ursprungliga värdet, och att de inte kunde hänga på gallret cirka 75 dagar efter tamoxifeninjektionen, eftersom RyR1-mängden hade nått en nivå på cirka 60 %. Muskelstyrkan bedömdes också genom ett 6 minuters icke-invasivt elektrostimuleringsprotokoll av gastrocnemiusmuskeln kopplat till anatomisk magnetisk resonanstomografi (MRI) under allmän anestesi. Under elektrostimuleringsprotokollet för CTRL-djuren 30 dagar efter tamoxifeninjektion (fig. 2c, D30) registrerades en typisk träningsprofil, med en stabil initial muskelstyrka som sakta minskade när muskeln tröttnade. I CTRL-gruppen vid D60 och D90 visade träningsprofilen en förbättrad muskelkraft när djuren blev äldre (fig. 2c). Däremot försämrades prestationen hos RyR1-Rec-djuren, i likhet med CTRL vid D30, med åldern. RyR1-Rec-djuren kunde inte längre utföra övningen vid D90 (fig. 2c, RyR1-Rec D90). Gastrocnemiusvolymen mätt med hjälp av MR-bilder (fig. 2d) förblev stabil hos CTRL-djuren från D30 (161 ± 5 mm3) till D90 (164 ± 4 mm3). I RyR1-Rec-möss var däremot gastrocnemiusvolymen betydligt mindre än hos CTRL-möss sedan D30 (141 ± 3 mm3, p = 0,003) och minskade ytterligare ned till 100 ± 3 mm3 vid D60 (p < 0,001 jämfört med CTRL vid samma ålder) och 69 ± 4 mm3 vid D90 (p < 0,001 jämfört med CTRL vid samma ålder). Den maximala specifika ryckspänningen (absolut ryckspänning normaliserad till muskelvolym) bekräftar att båda grupperna uppvisade liknande muskelstyrka vid D30 (fig. 2e), men RyR1-Rec-djurens styrka minskade dramatiskt medan den ökade hos CTRL-djuren när de blev äldre. Dessutom bedömdes förändringarna i gastrocnemiusmuskelns bioenergetik under elektrostimuleringen noninvasivt vid D60 med hjälp av in vivo 31-fosfor (31P) MR-spektroskopi. Medan det basala intramyofibrillära pH-värdet inte skiljde sig åt mellan de båda grupperna (Additional file 1: Fig. S2A) var acidosens omfattning i slutet av träningen lägre (p = 0,016) hos RyR1 Rec-djuren (Additional file 1: Fig. S2B), vilket tyder på att det glykolytiska flödet i den tränande muskeln var minskat hos dessa djur. Dessutom var tidskonstanten för fosfokreatinresyntesen efter träning (τPCr) betydligt kortare (p = 0,047) hos RyR1-Rec-möss (Additional file 1: Fig. S2C, D), vilket återspeglar en förbättrad mitokondriefunktion in vivo. PCr-syntesen under återhämtningsperioden efter träning är uteslutande beroende av oxidativ ATP-syntes, varför τPCr betraktas som ett index för den oxidativa fosforyleringskapaciteten . Sammantaget tyder dessa resultat på att en progressiv minskning av RyR1 är förknippad med en progressiv viktminskning och minskad muskelstyrka.

De fysiologiska egenskaperna hos isolerade fibrer äventyras hos RyR1-Rec-möss

Förändringen av muskelfunktionen karakteriserades ytterligare på enstaka muskelfibrer med hjälp av en kombination av spänningsklampor för hela celler och konfokal avbildning . T-tubuli-nätverket avbildades genom färgning av plasmamembranet med di-8-anepps. Ingen kvalitativ skillnad i nätverket (fig. 3a, vänster) eller kvantitativ skillnad i den genomsnittliga T-tubulärtätheten mellan CTRL- och RyR1-Rec-fibrer observerades, förutom en liten men signifikant förkortning av den genomsnittliga sarkomerlängden i vila (fig. 3a, graferna till höger). Det spänningsaktiverade Ca2+-inflödet genom DHPR (fig. 3b-d) och flödet av Ca2+-frisättning genom RyR1 (fig. 3e-i) bedömdes samtidigt. Jämfört med CTRL-fibrer uppvisade RyR1-Rec-fibrer spänningsaktiverade DHPR Ca2+-strömmar med liknande tidsförlopp (fig. 3b) men minskad täthet, vilket visades av toppströmtätheten i förhållande till spänningen i de två grupperna (fig. 3c), vilket översattes till en 30-procentig minskning av den maximala konduktansen (Gmax) utan någon tillhörande förändring av övriga parametrar i förhållandet mellan ström och spänning (fig. 3d). Spänningsberoendet av SR Ca2+-frisättning bedömdes genom linjebildning av det Ca2+-känsliga färgämnet rhod-2. Linjescanningsbilder från RyR1-Rec-fibrerna liknade kvalitativt dem från CTRL-fibrerna (fig. 3e) och visade en snabb ökning av fluorescensen vid depolarisering av T-tubulimembranen, som var rumsligt homogen längs den skannade linjen. Hastigheten för frisättning av SR Ca2+ (fig. 3g), beräknad från förändringarna i rhod-2-fluorescensen framkallad av depolariserande pulser med ökande amplitud (fig. 3f), uppvisade ett liknande tidsförlopp i RyR1-Rec-fibrer som i CTRL-fibrer, men, vilket är viktigt, toppvärdena var reducerade i RyR1-Rec. Anpassning av topphastigheten för SR Ca2+-frisättning i förhållande till spänningen (fig. 3h-toppgrafiken) visade att den maximala hastigheten för Ca2+-frisättning reducerades med 25 % i RyR1-Rec-gruppen (fig. 3i, Max), lutningsfaktorn (k) reducerades också något men signifikant, medan spänningen för mitten av aktiveringen (V0,5) var oförändrad. En liten (1,3 ms i genomsnitt) men signifikant ökning av tiden till topphastigheten för SR Ca2+-frisättning i RyR1-Rec-fibrerna (fig. 3h, nedre diagrammet) observerades. Inga ändringar observerades i fibrarnas förmåga att avlägsna cytosoliskt Ca2+ (SERCA-pumpfunktion), mätt med det Ca2+-känsliga färgämnet fluo-4 FF med låg affinitet i förhållanden utan EGTA-buffert (Additional file 1: Fig. S3). Sammantaget visar dessa resultat att den 35-procentiga minskningen av RyR1-mängden i interosseus är förknippad med en 30-procentig minskning av kalciumströmmen genom DHPR och en 25-procentig minskning av kalciumflödet genom RyR1.

RyR1-reduktion påverkar skelettmuskelstrukturen

För att bättre förstå grunden för dessa funktionella förändringar som är förknippade med en minskning av RyR1 undersöktes muskelstrukturen på RyR1-Rec-djur vid D75 efter rekombination, och jämfördes med CTRL-djur. Extensor digitorum longus (EDL), en muskel med snabb ryckning, soleus, en muskel med långsam ryckning och tibialis anterior (TA), en blandad muskel, analyserades med hjälp av hematoxylin-eosin-, NADH- och Gomori-trikromfärgningar. Färgningar av TA, som presenteras i figur 4a, visar onormal muskelstruktur hos RyR1-Rec-djur, utan fibros eller centrala kärnor, men med fiberatrofi, som påverkar både typ I- och typ II-fibrer (tabell 2). En desorganisation av mitokondrier som kännetecknas av lokal ackumulering/utarmning i intilliggande regioner i samma fiber (pilspets och inset Fig. 4a) och rödfärgningsackumulering som observerats med Gomori trichrome (Additional file 1: Fig. S4) observerades också, vilket liknar de dammiga kärnor som nyligen beskrivits hos patienter . Fiberatrofi observerades i båda fibertyperna i EDL, även om minskningen var något större i typ I-fibrerna (tabell 2). Transversal TA-sektion av CTRL- och RyR1-Rec-möss färgades med antikroppar mot RyR1 och desmin. Ingen förändring observerades i RyR1-fördelningen mellan typ I- och typ II-fibrer i RyR1-Rec TA-sektioner, vilket tyder på en liknande RyR1-reduktion i alla fibertyper (fig. 4b). Överraskande nog observerades en viktig förändring i desminfördelningen, med en enorm ökning i de små typ I-fibrerna (fig. 4b): i CTRL TA-sektioner uppvisade alla fibrer en liknande perifer färgning, medan de små typ I-fibrerna i RyR1-Rec TA-sektioner var kraftigt färgade både i fiberperiferin och i cytosolen (inlaga fig. 4b). Även om IF-märkningen inte är kvantitativ visar dessa resultat att RyR1-reduktionen troligen var homogen, utan någon stor skillnad mellan intilliggande fibrer som observerats för desmin, och den kvantifiering som utfördes med Western blot var reflektionen av proteinet som fanns i varje fiber och inte ett medelvärde av fibrer med 0 % RyR1 och fibrer med 100 % RyR1 inom samma muskel.

Triadernas organisation studerades vidare med hjälp av immunofluorescerande märkning av isolerade EDL-fibrer (fig. 5a). Märkningen av alfa-actinin (som en markör för Z-linjen), av triadin och av RyR1 (som triadmarkörer) på RyR1-Rec EDL-fibrer visade att minskningen av RyR1-mängden resulterade i en generaliserad desorganisering av fibern med onormal lokalisering av triader och avbrott i Z-linjen, men triadin och RyR1 var fortfarande delvis kolokaliserade. Även om triaderna fanns kvar på båda sidor av Z-linjen bildade Z-linjen inte en rak linje som i CTRL utan uppvisade i stället många mikrostörningar (infälld fig. 5a). Muskels ultrastruktur analyserades med hjälp av elektronmikroskopi på RyR1-Rec EDL-fibrer vid D75 (fig. 5b). Vissa regioner hade en relativt bevarad struktur (Fig. 5b, vänster fiber), medan vissa intilliggande regioner var mycket desorganiserade, med störningar i sarkomerens regelbundna organisation, desorganisering av mitokondrier och förekomst av många staplar av membran (Fig. 5b, pilar, förstorade i insatsen), tidigare kallade multipla triader . De morfologiska egenskaperna hos dessa multipla triader jämfört med de normala enkla triaderna presenteras i tabell 3, och ytterligare exempel presenteras i Additional file 1: Figur S5. Exakt kvantifiering av den förmodade T-tubulära bredden, den förmodade SR-bredden och intermembranutrymmet (T-tubuli/SR) (Additional file 1: Fig. S5) visade på en enorm ökning av T-tubuliens medelstorlek i dessa multipla triader (dubbelt så stor som 202 % av T-tubuliens storlek i den normala triaden), medan SR:s medelbredd endast ökade något (+ 10 %) och intermembranutrymmet inte ändrades. Dessa resultat pekar på en generaliserad strukturell desorganisering av RyR1-Rec-musmuskulaturen i samband med membranomvandling.

RyR1-reduktion är förknippad med modifiering av mängden av ett stort antal proteiner

Konsekvenserna av RyR1-reduktion undersöktes på molekylär nivå med hjälp av kvantitativ Western blot på quadricepsmuskulatur av CTRL eller RyR1-.Rec-möss (8 djur i varje grupp) vid D75 efter tamoxifeninjektion (Fig. 6). Den relativa mängden av ett stort antal proteiner som är direkt eller indirekt involverade i kalciumhanteringen uppskattades, med den totala mängden proteiner som bestämdes med hjälp av en färgfri utvärdering som referens. Ingen skillnad i kvantifieringen av RyR1 observerades mellan denna metod och användningen av myosin tung kedja som referensprotein (jämförelse mellan fig. 1, 6). Ingen signifikant förändring mellan CRTL- och RyR1-Rec-muskler observerades i mängden triadinisoform T95, det kalciumbindande proteinet CSQ1, Ca2+-ATPaset SERCA, det mitokondriella FoF1-ATPaset och alfa 1-underenheten av DHPR (fig. 6a, b). Däremot observerades en ökning av mängden STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), triadinisoformen T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004) och ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017). Eftersom ändring i lokaliseringen av strukturproteinet desmin observerades med hjälp av immunofluorescerande märkning (fig. 5b), kvantifierades även desmin-uttrycksnivån och en enorm ökning av desmin-mängden observerades (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). Lokaliseringen av CLIMP63 och STIM1 i RyR1-Rec EDL-fibrer analyserades med hjälp av immunofluorescerande märkning, och ingen större förändring observerades (Additional file 1: Fig. S6). Därför var RyR1-proteinminskningen förknippad med en ökning av olika proteiner som är involverade i kalciumreglering eller i muskelarkitektur.

Autofagi förändras till följd av RyR1-reduktion

Förändringar i autofagi har observerats i vissa myopatier . För att identifiera de mekanismer som leder till muskelatrofi efter RyR1-reduktion letade vi efter förändringar i autofagiflödet i RyR1-Rec-muskler. Mängden LC3 II, ett membranprotein i autofagosomerna, utvärderades med kvantitativt Western blot (fig. 7a, b), och en ökning av LC3 II observerades (172 % ± 32 %, p = 0,03). Denna ökning av autofagosomer kan återspegla antingen en ökad bildning av autofagosomer (på grund av en ökad autofagiprocess) eller en minskning av deras fusion med lysosomer (och därmed en hämning av autofagiavvecklingen). Den exakta karaktären av modifieringen av autofagiflödet analyserades ytterligare genom kvantifiering av p62, ett välkänt protein som specifikt bryts ned via autofagi, vars mängd också ökade signifikant (fig. 7a, b, 172 % ± 22 %, p = 0,006). Den associerade ökningen av LC3 II och av p62 i RyR1-Rec-muskel jämfört med kontroll tyder på att RyR1-reduktionen därför var förknippad med en hämning av autofagiflödet. Dessutom observerades en ökning av aktiveringen (fosforylering) av två hämmare av autofagi, mTOR och S6-protein (fig. 7b, c) (P-mTOR/mTOR ökning med 174 % ± 17 %, p = 0,01; P-S6/S6 ökning med 320 % ± 50 %, p < 0,001). Ökningen av fosforylering av dessa två autofagihämmare hos RyR1-Rec-djur jämfört med kontrollerna pekade ytterligare mot en hämning av autofagi som är ansvarig för muskelatrofin hos RyR1-Rec-djur.

Humana patienters biopsier uppvisar liknande defekter som de som observerats i RyR1-Rec-möss

I en nyligen genomförd studie på en stor kohort av patienter med en recessiv medfödd myopati har vi identifierat närvaron av atypiska strukturer, så kallade ”dammiga kärnor”, hos mer än hälften av patienterna med en minskad mängd RyR1. De observerades genom flera färgningar och skiljer sig från den klassiska centrala kärnan (väldefinierade områden utan oxidativ färgning) genom sina dåligt definierade gränser, sin fokala myofibrillära desorganisering, en rödlila granulär materialdeposition vid Gomori trichrome-färgning och ett blandat område med minskad eller/och ökad enzymatisk aktivitet vid oxidativ färgning (Additional file 1: Fig. S7). Dessa strukturella förändringar speglar de modifieringar som observerats i vår musmodell (Fig. 4 och Additional file 1: Fig. S7). Vi jämförde därför ytterligare vår nya musmodell och muskelbiopsier från patienter med en RyR1-proteinminskning och ”dammiga kärnor”. Med hjälp av kvantitativ Western blot uppskattades mängden av de proteiner som tydligt modifierades i vår musmodell även hos 5 patienter med recessiv ”Dusty Core”-sjukdom (två RyR1-mutationer som resulterar i RyR1-proteinreduktion – fig. 8a). Kontrollbiopsier av olika ålder (mellan 3,5 och 64 år) användes som referens. En stor minskning av RyR1-protein observerades hos alla patienter (genomsnittlig uttrycksnivå 19,8 % ± 2,2 % av CTRL, p < 0,001). Dessutom observerades en ökning av CLIMP63 och desmin. Minskningen av RyR1 var förknippad med en betydande ökning av CLIMP 63 (genomsnittlig ökning av uttrycksnivån femfaldig, 516 % ± 220 %). Dessutom var uttrycksnivån för desmin också drastiskt ökad hos patienterna jämfört med kontrollen (genomsnittlig ökning av uttrycksnivån 240 gånger, 24 170 % ± 7 635 %). Genom att använda elektronmikroskopi för att analysera patientbiopsiens ultrastruktur observerades många staplar av membran i de desorganiserade regionerna (fig. 8c, pilar) hos alla patienter. Dessa regioner, som liknade de staplar som observerades i RyR1-Rec-muskel (fig. 4b), pekade på en gemensam mekanism, både hos möss och människor, som leder till bildandet av dessa strukturer som ett resultat av RyR1-reduktionen. Med identiska modifieringar som hos patienter med Dusty Core Disease utgör denna modell således en relevant modell för att studera de patofysiologiska mekanismerna.