Fluorescerande antikroppstekniker

Av Benedette Cuffari, M.Sc.Granskad av Emily Henderson, B.Sc.

Sedan den ursprungliga upptäckten 1942 har immunofluorescensfärgning förblivit en mycket tillförlitlig och kraftfull teknik för ett stort antal forsknings- och diagnostiska ändamål.

Leukemiceller märkta med fluorescerande molekyler. Image Credit: Vshivkova/.com

I allmänhet innebär fluorescensantikroppsteknik (FA) att man använder celler eller en antikropp vars konstanta region har märkts med en fluorescerande etikett, även känd som en fluorofor. FA-tekniker kategoriseras ofta som antingen direkta eller indirekta.

Direkt fluorescensantikropp

Den direkta fluorescensantikroppstekniken, som annars kan kallas direkt immunofluorescens (DIF), innebär att man använder en enda fluorescerande märkt primärantikropp som används för att binda till ett målantigen. Vid klinisk användning är DIF särskilt användbar för snabb diagnos av bakteriesjukdomar som Streptococcus pyogenes, som är mer allmänt känd som streptokocker, samt lunginflammation som är resultatet av antingen Mycoplasma pneumoniae och Legionella pneumophilia species.

För sådana diagnostiska syften placeras patientprovet först på ett objektglas och exponeras sedan för den fluorescerande antikroppen. Varje bindning mellan den fluorescerande märkta antikroppen och målantigenet, vilket i dessa situationer skulle vara bakterier, kommer att få dessa ämnen att lysa upp vid undersökning med ett fluorescensmikroskop.

Förutom användningen som diagnostiskt verktyg används DIF också i stor utsträckning för vetenskapliga forskningsstudier. För sådana ändamål placeras ett fruset vävnadsprov som har skurits i 5 eller 6 mikrometer (µm) tunna sektioner på ett glasobjektsglas.

Objektsglasen inkuberas sedan med en fluorescerande märkt antikropp, som vanligtvis kommer att omfatta en panel av antikroppar som är riktade mot IgA-, IgG- och IgM-antikroppsisotyperna tillsammans med komplement 3, som är riktad mot antigenet av intresse.

Notera att koncentrationen av den antikropp som används för denna typ av undersökning kommer att baseras på tidigare experiment som har bekräftat vilken koncentration som kan ge det högsta förhållandet mellan signal och bakgrund.

När objektglasen har inkuberats i minst 30 minuter i mörker och vid rumstemperatur tvättas objektglasen och avbildas sedan med ett fluorescensmikroskop.

Bildkredit: anyaivanova/.com

Indirekt fluorescerande antikropp

I jämförelse med den enstegsteknik som används för DIF är indirekt IF (IIF) eller indirekt FA (IFA) en tvåstegsprocess som börjar med applicering av en omärkt primär antikropp på provet som är riktad mot ett målantigen. Det andra steget i IIF innebär användning av en fluorescerande märkt sekundär antikropp som är riktad mot Fc-delen av den primära antikroppen.

Och även om IIF anses vara mer komplicerat än DIF, eftersom det tar längre tid att genomföra och kräver användning av två kompatibla antikroppar, är det överlägset när det gäller känslighetskapaciteten.

Några vanliga kliniska tillämpningar av IFA-tester är bland annat de som används för att diagnostisera syfilis. För denna typ av IFA-test isoleras T. palladium-celler som tidigare isolerats från ett forskningsdjur och placeras på ytan av ett glasobjektsglas. Ett serum som erhållits från en patient sprids sedan över T. palladium-cellerna så att antitreponemala antikroppar, om de finns, kan binda till de fixerade antigenerna.

När patientens serumprov tvättats bort tillsätts en sekundär antikropp som har märkts med en fluorofor. Ett positivt syfilisresultat kommer att belysa alla sekundära antikropps-fluoroforkonjugatkomplex.

En annan typ av IFA som används i stor utsträckning i kliniska sammanhang är den som används för att diagnostisera systemisk lupus erythematosus (SLE). Patienter med SLE, som är en autoimmun sjukdom, kommer att ha en ökad nivå av cirkulerande antikärnära autoantikroppar (ANA) som är riktade mot både DNA och olika proteiner som binder till DNA.

För denna typ av IFA-test odlas celler och placeras sedan på ett glasobjektiv. Varje objektglas inkuberas sedan med en annan koncentration av patientens antikropp, som sedan tvättas för att avlägsna eventuella obundna proteiner.

Efter tvättsteget tillsätts en fluorescensmärkt sekundär antikropp, som för ANA-testet kommer att vara antihumant IgG, till objektglasen och tillåts att inkuberas. En titer av ANA i serum erhålls sedan från den högsta serumspädningen som visade fluorescens och används för att fastställa en SLE-diagnos.

Flödescytometri

Den tredje typen av teknik för fluorescerande antikroppar omfattar flödescytometri, vilket är ett automatiserat system för cellräkning som kan användas för att kvantifiera specifika celler som finns i komplexa blandningar, såsom blod eller serum.

Ett typiskt flödescytometriexperiment inleds med inkubation av en fluorescerande märkt antikropp som är riktad mot en specifik subpopulation av celler, t.ex. anti-CD4, som kan binda till glykoproteinet CD4 som finns på ytan av olika immunceller, inklusive T-hjälparceller, monocyter och makrofager. Flödescytometri kan också kvantifiera närvaron av flera celltyper genom att använda lämpliga celltillverkare.

När inkuberingen är avslutad förs provet sedan in i flödescytometern. I denna maskin tvingar en smal kapillär de celler som finns i provet att röra sig igenom i en enda fil. När cellerna rör sig genom kapillären används en laser för att aktivera och excitera alla celler som har märkts med fluoroforen.

Fluorescensintensiteten för varje exciterad cell mäts sedan av både framåt- och sidospridningsdetektorer och avbildas på ett histogram för analys. Förutom kvantifiering kan både flödescytometri och immunofluorescens användas för att sortera celler i renodlade subpopulationer för forskningsändamål genom en teknik som kallas fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Immunofluorescenstekniker. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Kapitel 20.5 Tekniker för fluorescerande antikroppar. In: Microbiology. Tillgänglig från https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). Immunofluorescensteknikerna vid diagnostik av endokrina autoimmuna sjukdomar. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

Fortsatt läsning

• Allt innehåll om antikroppar
• VHHH-antikroppar (nanobodies) Fördelar och begränsningar
• Antikroppsurval med hjälp av DNA Origami Scaffolds
• Användningar av histondeacetylas (HDAC)-antikroppar i Research
• Using Antibodies for Parkinson’s Disease Research

Skrivet av

Benedette Cuffari

Efter att ha avslutat sin kandidatexamen i toxikologi med två biämnen i spanska och kemi 2016, Benedette fortsatte sina studier och avslutade sin magisterexamen i toxikologi i maj 2018. Under forskarutbildningen undersökte Benedette dermatotoxiciteten hos mekloretamin och bendamustin; två alkylerande medel med kvävesenap som används i anticancerbehandling.

Citat